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文檔簡介
1、,生物親代與子代之間,在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上常常相似,這就是遺傳現(xiàn)象。生物的遺傳特性,使生物界的物種能夠保持相對穩(wěn)定。,根據(jù)現(xiàn)代細胞學和遺傳學的研究得知,控制生物性狀的主要遺傳物質(zhì)是脫氧核糖核酸(DNA)。,生物的各項生命活動都有它的物質(zhì)基礎(chǔ)。生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是什么呢?,金絲猴的后代仍然是金絲猴,牛的后代仍然是牛,遺傳物質(zhì)——DNA與RNA,第一組問題?,,DNA是遺傳物質(zhì)RNA也可以作為遺傳物質(zhì)核酸之外有其他遺傳物質(zhì)嗎?,
2、核素的發(fā)現(xiàn)肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗大腸桿菌噬菌體搗碎實驗化學實驗遺傳物質(zhì)必須具備的基本條件,DNA 是遺傳物質(zhì),DNA 是遺傳物質(zhì),核素的發(fā)現(xiàn) 1868年,瑞士F. Miescher從繃帶上的白細胞核中分離出一種含磷的酸性物質(zhì),命名為核素。核素的主要成分是染色質(zhì),是DNA和蛋白質(zhì)的混合物。這是首次對基因的化學本質(zhì)進行探索。核酸 這一名詞于20年后才被正式啟用。,19世紀末期, DNA和RNA已經(jīng)從細胞中分離出來,為進一步的化學分
3、析奠定了基礎(chǔ)。20世紀30年代搞清了DNA和RNA的基本化學組成。還注意到了DNA和RNA所含核糖的差異。,肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗,肺炎雙球菌有兩種類型光滑型(S型)粗糙型(R型),Griffth的肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實驗,,,,,,,,,隨堂雙基4:在肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實驗中,將R型活細菌與加熱后殺死的S型細菌混合后注射到小鼠體內(nèi),小鼠死亡,則此過程中小鼠體內(nèi)S型、R型細菌含量變化情況最可能是下圖哪個選項( ),,大腸桿菌噬菌體搗碎實
4、驗,大腸桿菌噬菌體搗碎實驗1952年Herchey 和Chase。用32P和35S分別標記噬菌體的DNA和蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)只有DNA進入宿主細菌內(nèi),而蛋白質(zhì)則沒有。,首先用含放射性同位素(如32P)的培養(yǎng)基培養(yǎng) ,然后再用上述細菌培養(yǎng),就可得到含放射性元素(如DNA分子中含32P)的T2噬菌體。,思考1 :制備含放射性同位素T2噬菌體的方法:,細菌,噬菌體,首先用含放射性同位素(如35S)的培養(yǎng)基培養(yǎng) ,然后再用
5、上述細菌培養(yǎng),就可得到含放射性元素(如蛋白質(zhì)外殼中含35S)的T2噬菌體。,細菌,噬菌體,如何制備32P標記的噬菌體?,如何制備35S標記的噬菌體?,32P標記的噬菌體DNA位置:,35S標記的噬菌體蛋白質(zhì)位置:,磷酸基,R基,,,噬菌體侵染細菌的過程:,最后,這些噬菌體由于細菌的解體而被釋放出來,再去侵染其他的細菌。,,,化學實驗不同生物的堿基組成不同,具有嚴格的種的特異性。單體在不同生物中都是相同的。A T G C 等
6、量四種堿基的分子濃度可變。,DNA是遺傳物質(zhì)的間接證據(jù),(1)一種生物不同組織的細胞,不論年齡大小,功能如何,它的DNA含量是恒定的,而生殖細胞精子的DNA含量則剛好是體細胞的一半。多倍體生物細胞的DNA含量是按其染色體倍數(shù)性的增加而遞增的,但細胞核里的蛋白質(zhì)并沒有相似的分布規(guī)律。,(2)DNA在代謝上較穩(wěn)定。(3)DNA是所有生物的染色體所共有的,而某些生物的染色體上則沒有蛋白質(zhì)。,(4)DNA通常只存在于細胞核染色體上,但某些能
7、自體復(fù)制的細胞器,如線粒體、葉綠體有其自己的DNA。(5)在各類生物中能引起DNA結(jié)構(gòu)改變的化學物質(zhì)都可引起基因突變。,(1)儲存并表達遺傳信息:(2)能夠復(fù)制,把遺傳信息傳遞給子代: (3) 物理和化學穩(wěn)定性:(4)有遺傳變化的能力:,遺傳物質(zhì)必須具備以下基本條件:,某科學家做“噬菌體侵染細菌的實驗”時,對噬菌體的DNA用32P標記,讓其中一個已標記的噬菌體去侵染未標記的細菌,最后釋放出100個噬菌體,則下列說法正
8、確的是( )A.噬菌體侵染細菌的實驗可以證明DNA是主要的遺傳物質(zhì)B.最后釋放出的100個噬菌體中,有98個噬菌體的DNA含32PC.標記噬菌體的方法是用含32P的培養(yǎng)基培養(yǎng)噬菌體D.標記噬菌體的方法是用含32P的培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌,再用此細菌培養(yǎng)噬菌體,,,,,RNA也可以作為遺傳物質(zhì),RNA病毒:一些病毒也采用另一種核酸-RNA作為遺傳物質(zhì),如逆轉(zhuǎn)錄病毒。煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus, TMV),
9、設(shè)計實驗:,蛋白質(zhì),RNA,,,,,設(shè)計思路:,技術(shù)方法:,將蛋白質(zhì)與RNA分離,單獨觀察,自身分離、化學提取分離、酶解法分離,,分離DNA與蛋白質(zhì)的技術(shù)手段有三類:(1)自身分離。(同位素標記觀察)(2)化學提取法分離RNA與蛋白質(zhì),(3)用RNA酶和蛋白酶分別處理噬菌體,,,分離,分離,重組,重組,感染,新的病毒,,,,產(chǎn)生哪種病毒?,,類病毒(viroid),類病毒:不具蛋白質(zhì)衣殼,僅有RNA組成的新病毒。 1922年
10、 美國 馬鈴薯紡錘形塊莖病毒。特點:單股閉合環(huán)狀的RNA分子,分子量約105da。能耐受紫外線和作用于蛋白質(zhì)的各種理化因素,在90℃下仍能存活。,類病毒復(fù)制如何進行?由宿主細胞的酶來完成,其RNA作為復(fù)制模板。類病毒現(xiàn)在僅在高等植物中發(fā)現(xiàn),一般通過接觸,擦傷,節(jié)肢動物和菟絲子傳播。,非核酸的其他遺傳物質(zhì),朊病毒:又稱蛋白質(zhì)侵染因子。朊病毒是一類能侵染動物并在宿主細胞內(nèi)復(fù)制的小分子的無免疫性疏水蛋白質(zhì)。,羊瘙癢病1982年
11、,美國發(fā)現(xiàn)羊瘙癢病是蛋白質(zhì)侵染引起的疾病,并稱為“Prion”即朊病毒。馬鹿和鹿的慢性消瘦病、貓的海綿狀腦病。1996年春天“瘋牛病”:牛海綿狀腦炎人慢性退化性紊亂疾病:老年癡呆、帕金森氏病、糖尿病等。,朊病毒引起的風波,致病,正常朊蛋白構(gòu)型發(fā)生異常改變后導(dǎo)致瘋牛病,無需DNA或RNA的參與,致病因子朊蛋白就可以傳染復(fù)制。所謂朊病毒的繁殖就是正常的PrPC蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSC的過程,而且朊病毒感染后也具有指數(shù)增長的特性。,1)
12、合成朊病毒所需的信息可能存在于寄主細胞中朊病毒的作用,僅在于激活在寄主細胞中為朊病毒的編碼的基因,使得朊病毒得以復(fù)制繁殖。2)朊病毒的蛋白質(zhì)能為自己編碼遺傳信息發(fā)生逆轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生為朊病毒編碼的RNA或DNA,必須存在逆轉(zhuǎn)譯酶,甚至還要有逆轉(zhuǎn)錄酶。蛋白質(zhì)指導(dǎo)下的蛋白質(zhì)合成,即蛋白質(zhì)本身可作為遺傳信息。,朊病毒的復(fù)制機理:,大多數(shù)生物以 DNA 為遺傳物質(zhì)(細胞生物, DNA 病毒)少數(shù)生物以 RNA 為遺傳物質(zhì)( RNA 病毒)
13、所以 核酸 是一切生物的遺傳物質(zhì),DNA 是主要的遺傳物質(zhì)。蛋白質(zhì) 不是 (是,不是)遺傳物質(zhì)。,,,,,,,,,,,總結(jié),核酸(DNA、RNA)的化學組成,,第二組問題?,嘧啶,嘌呤,1 含氮堿基、核苷、核苷酸,☉ 堿基,,,,DNA: D-2-脫氧核糖 A,G,C,TRNA: D-2-核糖 A,G,C,U,2 核酸的化學組成,核酸的元素組成,C、H、O、N、
14、P(9-10%),核酸,核苷酸,磷酸,核苷,戊糖,堿基,3 DNA的一級結(jié)構(gòu):即是指四種核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)按照一定的排列順序,通過磷酸二酯鍵連接形成的多核苷酸也稱為堿基順序。,DNA一級結(jié)構(gòu)的兩種縮寫方式:,線條式:,…pTpGpCpApT… …pT-G-C-A-T…,文字式:,1 DNA雙螺旋模型的提出2 維持DNA雙螺旋的力3 雙螺旋結(jié)構(gòu)的基本形式4 變性和復(fù)性,第三組問題?,研究背景:
15、1950年,大量不同來源DNA樣品的分析發(fā)現(xiàn)了DNA組成的當量規(guī)律,即A=T,G=C,A+G=C+T。不同生物種屬的DNA堿基組成不同,同一個體不同器官、不同組織的DNA具有相同的堿基組成。,1 DNA雙螺旋模型的提出,理論化學家L. Pauling運用化學的簡單定律來推理,研究了蛋白質(zhì)?-螺旋結(jié)構(gòu),此方法啟發(fā)了Watson和 Crick。M. Wilkins、R. Franklin等在DNA的X-射線晶體結(jié)構(gòu)方面作出了重大的貢獻
16、。,R. Franklin的X-射線衍射圖,1953年沃森和克里克提出DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的提出:,Fig. 2-5 Watson and Crick’s paper in Nature 1953.,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點:① 脫氧核糖和磷酸通過3’,5’磷酸二酯鍵交互連接,成為螺旋鏈的骨架。兩條鏈方向以反向平行的方式組成右手雙螺旋。,② 堿基互補配對:只有A和T配對,G和C配對才能滿足正常螺旋(直徑
17、20 Å )的要求和chargaff的當量規(guī)律。,堿基互補配對原則應(yīng)用,設(shè)DNA一條鏈為1鏈,互補鏈為2鏈。根據(jù)堿基互補配對原則可知:A1=T2 , A2=T1, G1 = C2 , G2 =C1。則在DNA雙鏈中: A = T , G = C,例題1、某雙鏈DNA分子中,G占23%,求A占多少?,解析:,因為DNA分子中,A+G=T+C。所以,,A=50%–23%=27%,③ 螺旋參數(shù)螺旋直徑2nm。螺旋每旋轉(zhuǎn)一周1
18、0對堿基,每個堿基的旋轉(zhuǎn)角度為36°。螺距3.4nm;堿基平面之間的距離為0.34nm。,④ 大溝小溝 對于遺傳上有重要功能的蛋白質(zhì)識別DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)上的特定信息是非常重要的。大溝(2. 2nm)小溝(1. 2nm),2 維持DNA雙螺旋的力,氫鍵GC之間有三條氫鍵,AT之間有兩條氫鍵,這是DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的重要特征之一,DNA的許多物理性質(zhì)如變性、復(fù)性以及Tm值等都與此有關(guān)。,堿基堆集力 DNA同一條鏈
19、相鄰堿基之間的非特異性作用力,包括疏水作用力和范德華力。 疏水作用力:不溶于水或難溶于水的兩個分子在水中具有相互聯(lián)合,成串聯(lián)地結(jié)合在一起的趨勢。 嘌呤和嘧啶有一定程度的疏水性,雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部形成一個強大的疏水區(qū),使DNA相鄰的堿基有相互堆集在一起的趨勢,這是形成堿基堆集力的重要因素之一。,范德華力:存在于分子間的一種吸引力; DNA雙鏈中嘌呤環(huán)和嘧啶范環(huán)德華的半徑是1.7 Å左
20、右 ,其累積的范德華力是相當可觀的,這樣范德華力加強了疏水作用,這是形成堿基堆集力的另一個重要因素。,氫鍵與堿基堆集力的協(xié)同作用已經(jīng)堆基的堿基更容易發(fā)生氫鍵的鍵合,相應(yīng)地已經(jīng)被氫鍵定向的堿基更容易堆集。兩種作用力相互協(xié)同,形成一種非常穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。如果一種作用力被消除,另一種作用力也大為減弱。,磷酸基團間的靜電斥力 帶負電荷的磷酸基的靜電斥力,所以DNA需要保存在含 Na+ 生理鹽條件 。 堿基分子內(nèi)能
21、 物體的內(nèi)能是物體內(nèi)全部分子的分子動能與分子勢能之和。溫度升高,堿基分子內(nèi)能增加時,堿基的定向排列遭受破壞,消弱了堿基的氫鍵結(jié)合力和堿基的堆集力,會使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞。,不穩(wěn)定因素,3 雙螺旋結(jié)構(gòu)的基本形式,三種不同形式的DNA構(gòu)象,,A,B,Z型雙螺旋的特性,,A,B,Z,大溝寬,小溝窄,小溝窄,大溝窄深,小溝寬深,大溝不存在,小溝窄而深,A構(gòu)象:在相對濕度75%以下獲得的DNA纖維具有不同與B-DNA的結(jié)構(gòu)特點。DN
22、A-RNA雜交分子和RNA-RNA雙鏈結(jié)構(gòu)均采取A構(gòu)象。Z-DNA的形成是DNA單鏈上出現(xiàn)嘌呤和嘧啶交替排列所造成的,比如CGCGCGCG或CACACACACA。,Z-DNA有什么生物學意義呢?Z-DNA在熱力學上是不利的。帶負電荷的磷酸根距離太近,產(chǎn)生靜電排斥。DNA鏈的局部不穩(wěn)定區(qū)的存在就成為潛在的解鏈位點。DNA解鏈是DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過程中必要的環(huán)節(jié),因此Z-DNA的結(jié)構(gòu)與基因調(diào)節(jié)有關(guān)。,B-DNA是活性最高的 DNA構(gòu)
23、象, B-DNA變構(gòu)成為A-DNA后,仍有活性,但若局部變構(gòu)為Z-DNA后則活性明顯降低。,三種不同構(gòu)象的DNA活性,變性和復(fù)性 變性,概念:在某些理化因素作用下,DNA分子互補堿基對之間的氫鍵斷裂,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散,變成單鏈的過程。,常用的變性方法,☆ 熱變性,☆ 堿變性,應(yīng)用廣泛,特別是用于變性動力學研究,缺點:高溫引起磷酸二酯鍵的斷裂,得到長短不一的單鏈,pH11.3時,全部氫鍵被淘汰,無熱變性的缺點,為制備單鏈DN
24、A的首選方法,核酸變性程度的鑒定——紫外測定法:原理:嘌呤堿、嘧啶堿存在共軛雙鍵,堿基、核苷、核苷酸、核酸在240-290nm處有強烈的紫外吸收,最大吸收峰在260nm處。,紫外光吸收值: 1 雙鏈DNA A260=1.00 2 單鏈DNA A260=1.37 3 自由堿基 A260=1.60,,1.185,℃,,熔解曲線與Tm值 緩慢而均勻地增加DNA溶液的溫度(現(xiàn)可做到 0
25、.1 ℃/分)可根據(jù)各點的A260值繪制成DNA的熔解曲線。,這也是一般PCR實驗技術(shù)中把變性溫度定為94℃的原因,熔鏈溫度Tm,影響DNA Tm值大小的因素:,DNA的均一性:G-C含量: Tm值計算公式:Tm=69.3+0.41 (G+C)% GC%=(Tm-69.3)×2.44介質(zhì)中的離子強度:DNA保存在高濃度的緩沖液中,如
26、 1mol/LNaCl中。,復(fù)性及雜交,DNA復(fù)性 變性DNA在適當條件下,分開的兩條單鏈分子按照堿基互補原則重新恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象的現(xiàn)象,又稱為退火。,,,DNA的復(fù)性的條件有兩個:(1)有足夠的鹽濃度以消除磷酸基的靜電斥力;(2)有足夠高的溫度以破壞無規(guī)則的鏈內(nèi)氫鍵,但又不能太高,一般使用比Tm值低20-25℃ 。,復(fù)性的機制 一般認為需要10-20個堿基對,特別是富含GC的節(jié)段首先形成一個(或幾個)雙螺旋核心
27、,這一步叫成核作用。然后兩條單鏈的其余部分就會迅速形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。絕大部分的復(fù)性DNA分子都不是原配的。,復(fù)性的影響因子:,溫度和時間:低于Tm值 25℃左右 (60-65℃) DNA濃度: DNA片段的大?。?DNA順序的復(fù)雜性; 反應(yīng)溶液中的離子強度。,多聚酶鏈式反應(yīng)( PCR)是一種DNA體外擴增技術(shù),其基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。在待擴增的DNA片段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補的兩個寡核苷酸引物,經(jīng)變性、退火和延伸
28、若干個循環(huán)后,DNA擴增2n倍。,雜交,雜交:親緣關(guān)系很近的不同來源的DNA單鏈或RNA單鏈與DNA單鏈之間通過堿基互補形成雜交分子的過程。,圖 核酸雜交及其應(yīng)用示意圖1,粗細線分別代表不同DNA。,雜化雙鏈,B代表天然DNA;C是B的缺失突變體;虛線框內(nèi)是已缺失的部分,D顯示從天然DNA鏈鼓出小泡.,Ⅱ.突變體的鑒別,I 變性、復(fù)性和雜交,Ⅲ.分子探針標記,核酸分子探針: 用同位素、生物素或熒光染料標記一小段已知核苷酸序列作為探針,
29、探針的序列如果與DNA或RNA序列互補,就可以探知核酸分子。,粗線表示分子探針,圖 核酸雜交及其應(yīng)用示意圖2,雜交分類:1)液相雜交:不同來源的DNA在溶液中進行雜交。2) 濾膜雜交:將DNA或RNA吸附到硝酸纖維素膜上再進行雜交。Southern雜交:用于鑒別DNA的雜交Northern雜交:用于鑒別RNA的雜交,Southern 印跡法:,DNA,,限制片段,限制性內(nèi)切酶,,帶有DNA片段的凝膠,瓊脂糖凝膠電泳,,堿液浸
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