斑節(jié)對蝦Toll9受體基因信號調(diào)控功能及免疫特性分析.pdf

1、斑節(jié)對蝦是沿海地區(qū)重要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，對于水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展貢獻(xiàn)極大。由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化及各類病毒、細(xì)菌性疾病的爆發(fā)，斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖所面臨的挑戰(zhàn)前所未有的嚴(yán)峻。通過了解其先天性免疫防御機(jī)制，采取有效手段增強(qiáng)其抗病力是重要的解決方法。作為無脊椎生物，對蝦主要依靠先天性免疫途徑來進(jìn)行免疫調(diào)控與防御，而Toll樣受體是對蝦先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。Toll樣受體是先天性免疫模式識別受體(pattern recognition receptor，

2、PRR)中重要一員，主要免疫方式是通過抵御外源病原微生物的入侵進(jìn)而發(fā)揮免疫功能。Toll樣受體可識別特異性病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMP),可將病原感染信號轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，形成信號級聯(lián)反應(yīng)再傳遞到核內(nèi)，實現(xiàn)各類免疫分子的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)與釋放，并顯著激活先天性免疫系統(tǒng)。斑節(jié)對蝦Toll受體免疫機(jī)制的研究有助于深入了解對蝦抵御病原反應(yīng)的具體機(jī)制。本研究以斑節(jié)對蝦Toll9基因OR

3、F全長為模板，首次以哺乳動物細(xì)胞和果蠅細(xì)胞構(gòu)建免疫模型來探究PmToll9對于TLR/Toll信號通路的調(diào)控及應(yīng)對病原的免疫特性，并對其蛋白序列進(jìn)行了結(jié)構(gòu)預(yù)測與生物性分析。體外結(jié)合病原實驗證明PmToll9可識別部分革蘭氏陰性菌，并可以廣譜性識別PAMPs；體內(nèi)微生物侵染證明革蘭氏陽性菌可刺激PmToll9上調(diào)表達(dá)，而革蘭氏陰性菌具有抑制表達(dá)作用?；诩?xì)胞免疫模型，應(yīng)用各種檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)PmToll9可通過激活NF-κB啟動子的活性實現(xiàn)對

4、TLR信號通路的調(diào)控，并通過激活抗菌肽表達(dá)促進(jìn)Toll通路信號分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時介導(dǎo)TLR/Toll通路下游因子的差異性表達(dá)，證明PmToll9可參與免疫系統(tǒng)的調(diào)控。免疫刺激實驗證明LPS、Poly(I:C)-HMW、Poly(I:C)-LMW、R848、ODN2006、CL097、Rec FLA-ST和Peptidoglycan等配體并不能被PmToll9直接識別，說明PmToll9識別配體可能需要介質(zhì)因子Spatzle的存在。缺失突變

5、體實驗證明缺失LRR區(qū)域后，PmToll9對NF-κB的激活能力會顯著降低，其中缺失LRR4和LRR10/11/12的突變體對NF-κB的激活能力下降的最為顯著，LRR4和LRR10/11/12可能是PmToll9關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域。具體研究成果闡述如下：
　　1. PmToll9原核表達(dá)和結(jié)合特性分析
　　經(jīng)驗證，相比IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)更適用于PmToll9和胞外區(qū)重組蛋白的分離純化及相關(guān)功能研究。ELISA實驗

6、顯示Toll9-ED蛋白對Poly（I:C）-LMW/HMW、ODN2006、LPS和Resoquimod等PAMPs均具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，表明Toll9-ED蛋白具有廣譜的PAMPs識別活性；PmToll9-ED對部分革蘭氏陰性菌有明顯的結(jié)合能力，而對嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）結(jié)合能力較弱，說明PmToll9可能是通過結(jié)合PAMPs來識別和抵御

7、部分革蘭氏陰性菌感染。斑節(jié)對蝦體內(nèi)細(xì)菌刺激實驗結(jié)果顯示無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）可激活斑節(jié)對蝦肝胰腺、腸、淋巴和鰓組織中PmToll9的表達(dá)，哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）可顯著抑制PmToll9在肝胰腺中的表達(dá)。提示革蘭氏陽性菌S. agalactiae可通過PmToll9激活Toll信號通路，引起機(jī)體免疫防御反應(yīng)，而革蘭氏陰性菌V. harveyi對此過程具有一定抑制作用。
　　

8、2.PmToll9對哺乳動物TLR信號通路的誘導(dǎo)
　　結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)PmToll9胞外區(qū)有12個亮氨酸富集區(qū)（LRRs），不含信號肽序列，但含有12個N-糖基化預(yù)測位點和119個預(yù)測的磷酸化位點；其胞內(nèi)區(qū)與果蠅Toll9、岡比亞按蚊Toll9等物種TIR區(qū)域相似度最高。PmToll9空間結(jié)構(gòu)為馬蹄狀，其凹面區(qū)形成光滑且彎曲的β折疊結(jié)構(gòu)，推測參與配體識別。免疫印跡方法證實PmToll9重組真核蛋白可在HEK293T細(xì)胞中成功表達(dá)；Du

9、al-luciferase檢測發(fā)現(xiàn)PmToll9顯著激活NF-κB啟動子的活性，未能激活I(lǐng)SRE與IFN-β啟動子，且在200ng轉(zhuǎn)染濃度處PmToll9對NF-κB報告基因的激活效果顯著。qRT-PCR數(shù)據(jù)證明PmToll9成功激活HEK293T細(xì)胞 TLR信號通路，促進(jìn)通路下游因子 MyD88、TRAF-6、IL-8、IL-10、IκB-α的上調(diào)表達(dá)，同時ELISA結(jié)果證明PmToll9可促進(jìn)TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。缺失突變

10、體的構(gòu)建表明 LRR缺失突變可以導(dǎo)致PmToll9對NF-κB激活能力降低，其中缺失LRR4和LRR10/11/12的突變體呈現(xiàn)出更顯著的表達(dá)下調(diào)作用，說明LRR4和LRR10/11/12區(qū)域可能是PmToll9介導(dǎo)信號傳遞的關(guān)鍵功能域。Hela細(xì)胞定位實驗顯示PmToll9-GFP重組蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)中。
　　3.Toll9在果蠅Toll通路的激活表達(dá)
　　以果蠅S2細(xì)胞構(gòu)建了體外表達(dá)模型，報告系統(tǒng)顯示PmToll9可以

11、明顯激活果蠅抗菌肽Drosomycin和對蝦抗菌肽PEN453、PEN536和crustin-like的表達(dá)，并促進(jìn)下游因子Tube/Cactus/Dorsal/Dif/Drosomycin等表達(dá)水平的升高，說明PmToll9可通過激活抗菌肽的表達(dá)促進(jìn)Toll通路相關(guān)信號分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)。免疫刺激實驗顯示果蠅S2細(xì)胞經(jīng)Peptidoglycan(PGN)、poly(I:C)-LMW和poly(I:C)-HMW刺激后，報告基因被顯著激活，果蠅T

12、oll通路下游因子Tube/Cactus/Dorsal/Dif/Drosomycin呈現(xiàn)差異性表達(dá)。基于上述結(jié)果，推測PmToll9激活的信號分子轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑為Toll/Sp?tzle/NF-κB/Tube/Cactus/Dorsal/Dif/Drosomycin。LRRs缺失突變說明LRR3/4/10/11/12等區(qū)域可能具有特殊位點，對PmToll9的配體識別過程具有重要作用。
　　本研究應(yīng)用多種生物技術(shù)探究了PmToll9對哺乳