動物細胞工程--第四章-動物干細胞

1、第四章 動物干細胞,第一節(jié) 干細胞的概念和分類一、概念,干細胞（Stem cell）是一類具有自我更新和分化潛能的細胞,能產生表型和基因型與自己完全相同的子細胞，并具有不同分化潛能。,胚胎干細胞,形態(tài)特征：圓形或橢圓形，體積小，核質比大；生化特征：較高的端粒酶活性；一般都有獨特的表 面標志；增殖特征: 自穩(wěn)定性：單細胞或無脊椎動物——不對稱分裂 哺乳動物—

2、—種群意義上的不對稱分裂分化特征：是干細胞最重要的特征。干細胞本生不 是終末分化細胞，具有再分化的潛力。,干細胞的主要生理特征：,,,二、分類一）根據(jù)發(fā)生來源分類胚胎干細胞：成體干細胞：,來自早期胚胎（ESC）、原始生殖細胞（PGC）、或畸胎瘤組織（EC）等,如骨髓造血干細胞（HSC），間質干細胞（MSC），神經(jīng)干細胞（NSC）,ESC,什么是畸胎瘤,如果在胚胎不同時期，某些多能細胞從整體上分離或脫落

3、下來，使細胞基因發(fā)生突變，分化異常，則可發(fā)生胚胎異常。一般認為，這種分離或脫落發(fā)生于胚胎早 期，則形成畸胎；而如發(fā)生于胚胎后期，則形成了具有內胚層、中胚層和外胚層三個胚層的異常分化組織，即形成了畸胎瘤。,,鼻咽畸胎瘤,淋巴管瘤,生殖嵴與PGC（原始生殖細胞）,,成體干細胞：神經(jīng)干細胞,,,二）根據(jù)分化潛能分類全能干細胞：如ESC多能干細胞：如造血干細胞、間充質干細胞定向祖細胞：如造血母細胞等。專能干細胞：皮膚干細胞，成

4、肌細胞等,,三）根據(jù)干細胞存在的組織器官分類胚胎干細胞造血干細胞神經(jīng)干細胞肝臟干細胞皮膚干細胞肌肉干細胞等,第二節(jié) 胚胎干細胞,通過建立體外培養(yǎng)的方法，獲得保持增殖且不分化的胚胎干細胞系的技術稱為胚胎干細胞的建系。一、胚胎來源的干細胞系（p132 圖6-1）1. 囊胚階段的內細胞團（ICM）2. 來源于生殖嵴部位的原始生殖細胞（PGC）3. 來源于畸胎瘤組織（EC）,二、胚胎干細胞的建系,主要步驟包括：1. 培養(yǎng)體

5、系的選擇和準備2. 胚胎采集3. ICM的獲取4. ICM的離散5. ESC的建系,1. 培養(yǎng)體系的選擇和準備,飼養(yǎng)層細胞的準備：飼養(yǎng)層細胞一方面對ESC細胞帖壁起支持作用，另一方面其分泌蛋白可抑制ESC分化，維持其增殖特性和多能性。常用飼養(yǎng)層細胞為成纖維細胞（如STO成纖維細胞系）、子宮內皮細胞、3T3細胞株等。為了阻斷飼養(yǎng)層細胞的分裂，而不影響其分泌蛋白的產生，通常采用γ射線或絲裂霉素C處理之。,,培養(yǎng)基的準備：用D

6、MEM（高糖）培養(yǎng)液，其中胎牛血清的濃度和質量很重要，還要加非必須氨基酸；β-巰基乙醇。常采用添加LIF等抑制ESC的分化潛能；添加EGF等生長因子來促進ESC的增殖。,LIF抑止胚胎干細胞分化的信號通路,LIF 干細胞表面的LIF受體和gp130蛋白形成異二聚體 激活JAK酪氨酸激酶系統(tǒng)

7、 激活MAP激酶ERK級聯(lián)反應和STAT3蛋白 STAT3形成同型二聚體入核 激活核內靶基因轉錄 表達相應蛋白抑止ESC的分化,,,,,,,2. 胚胎的采集一般囊胚期胚胎或后桑葚胚

8、。3. ICM的獲取1）直接分離法：囊胚于飼養(yǎng)層上自行發(fā)育成孵化囊胚，待ICM擴大增殖時挑取。或使用鏈霉蛋白酶處理ZP，獲得裸胚培養(yǎng)。2）免疫分離法：鏈霉蛋白酶去除囊胚晚期胚泡ZP，依次轉移至補體滅活和未滅活的抗血清中，去除滋胚層細胞后，吸取ICM，移至飼養(yǎng)層培養(yǎng)。,4. ICM的離散胰蛋白酶消化即可離散ICM。5. 胚胎干細胞建系,三、胚胎干細胞的應用,,第三節(jié)、胚胎干細胞的生物學特性與鑒定方法,一、生物學特性增殖與分化

9、特征：永生化(immortal)；能維持穩(wěn)定的正常的二倍體染色體結構；有穩(wěn)定的發(fā)育潛能，能被誘導增殖或分化；能參與胎兒所有組織的發(fā)育過程；,形態(tài)特征體積小、核大，有一個或多個核仁；胚胎干細胞克隆緊密堆積，細胞之間無明顯的界限，細胞克隆有一定形狀規(guī)律。生化特征具有堿性磷酸酶和端粒酶活性；表達SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60等表面標志；表達OCT-4蛋白；,,Otc4基因,Otc4基因被認為在整個卵子生成和囊

10、胚附殖前以及早期外胚層中都表達，是受精卵全能性的關鍵。Otc4基因只能在胚胎中才能得到完全表達，而在成體動物體細胞中的表達基本上被關閉。這就意味著克隆人技術的第一步就存在很大問題。所以Otc4也被稱為克隆人終結者。,二、胚胎干細胞的鑒定方法,1. 形態(tài)鑒定：核質比大，體積小，細胞集落小鼠呈鳥巢狀，牛、豬等呈饅頭狀，人呈扁平、松散聚合體。2. 核型分析：二倍體核型，染色體受損情況等。,3. ESC特異性表面抗原表達的鑒定：小鼠

11、ESC以SSEA-1為主，人以SSEA-3、SSEA-4為主。此外，ALP、Otc-4等都可作為表面標志。4. 端粒酶活性鑒定：端粒長度及端粒酶活性檢測。5. 體內外分化能力鑒定：體內外分化能力鑒定,改變細胞的培養(yǎng)條件: 改變細胞的培養(yǎng)條件是ES細胞定向分化的基本策略,常用的方法有:與輔助細胞共培養(yǎng);在半固體培養(yǎng)基中原位生長分化;添加生長因子、化學誘導劑等。導入外源性基因,使其分化為某一特定類型的細胞。

12、體內定向分化,使ES 細胞多數(shù)分化為該組織特異性的細胞。,三、胚胎干細胞定向誘導分化的方法,胚胎干細胞的誘導分化： 胎牛血清，骨髓基質細胞共培養(yǎng)胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－?造血細胞 　RA胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－?神經(jīng)細胞 DMSO胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－?肌肉細胞

13、 TGF-B1, VEGF, bFGF胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－?血管和內皮細胞 RA+胰島素+T3胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－?脂肪細胞 BMP-2, BMP-4胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－?軟骨細胞 　地塞米松，磷酸甘油胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－?骨細胞

14、 基因轉染胚胎干細胞－－－－－－－－－－－－－－－?胰島素分泌細胞,人胚胎干細胞注射至免疫缺陷小鼠的后腿肌肉中形成的各種組織：（a）腸樣結構；(b)神經(jīng)上皮花結；(c）骨骼；(d)軟骨 ；(e)橫紋肌；(f)腎。,A.小鼠成纖維飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)8天后的ICM（標尺＝100um）B.ICM中分離出的H9細胞系（標尺＝100um）C. H9細胞系（標尺＝50um）D.在無小鼠胚胎成纖維細胞，但

15、有LIF（20ng/ml）的條件下培養(yǎng)5d后，H9細胞發(fā)生分化（標尺＝100um）,第四節(jié)、成體干細胞,一、概念和生物學特征概念： 指一群分布在成體組織中尚未分化的、具有自我更新、并負有構建和補充某種組織的各種類型細胞潛能的干細胞。生物學特征：1、慢周期性2、自我更新和再生能力的有限性3、不對稱分裂4、細胞鑒定標志,二、成體干細胞的分離與鑒定（以HSC為例）無菌采集骨髓 低滲處理 密度梯度離

16、 心 獲單核細胞 CD34抗體標記 流式細胞儀分離結合免疫吸附分離 鑒定。,,,,,,,如造血干細胞的鑒定：,細胞形態(tài) ：集落呈非貼壁生長，細胞形態(tài)較小細胞表面標志：flk-1（Fetal Liver Kinase 1); L/TAL-1； CD34；GATA-1；基因表達：TAL-1；GATA-2 ；βH1；β主要珠蛋白 體外

17、移植：漿細胞移植給患者能恢復造血功能，并且二次移植仍可重建造血系統(tǒng)。,三、成體干細胞的應用：細胞移植技術,細胞類型 治療的疾病神經(jīng)細胞 　　 中風、帕金森氏病、老年癡呆癥、 脊髓損傷、多發(fā)性硬化病心肌細胞 心臟病發(fā)作、充血性心臟病產生胰島素的

18、細胞 糖尿病軟骨細胞 骨性關節(jié)炎血細胞 癌癥、免疫缺乏癥、遺傳學血液 病、白血病肝細胞肝炎、肝硬化皮膚細胞燒傷骨細胞骨質疏松癥視網(wǎng)(眼)細胞黃斑癥骨骼肌細胞 肌肉萎縮癥,作

19、業(yè)題,1、什么是干細胞？如何分類？2、干細胞有什么生物學特性？3、簡述來源于ICM的胚胎干細胞分離方法。4、ESC培養(yǎng)時常用的飼養(yǎng)層細胞有哪些？其作用是是什么？5、什么是成體干細胞？有哪些種類？,補充知識：組織工程,１.組織工程的概念　　應用工程學和生命科學的原理和方法，研究細胞、組織誘導因子和生物材料間相互作用的關系，研制生物性替代物用以修復或重建組織器官的結構，維持、恢復和改善病損組織或器官的功能。,,1993年Lange

20、r及Vacanti兩位學者在著名的”Science”學術期刊上提出組織工程(tissue engineering)的構想，隨後根據(jù)此構想將軟骨細胞培養(yǎng)於人耳形狀的生醫(yī)材料上，再植入老鼠背部(上圖)，形成具有耳朵外觀的組織，此一前瞻性技術成為組織工程研究的先驅。,2.組織工程的方法,活體組織細胞分離 與胞外基質分子混合 細胞體外培養(yǎng)擴增形成組織

21、 移植到體內,,,,３.組織工程的三要素細胞、支架、信號,（1）種子細胞,細胞必須能不斷進行細胞分裂，且必須能被調控分化成特定的組織細胞 干細胞：胚胎干細胞、成體干細胞(如MSC) 組織來源細胞：自體或異體組織細胞,Growth factor stimulation,（2）組織生長支架需求：,,符合生物安全性要求合適的可生物降解吸收性合適的孔尺寸、高孔隙率和相連的孔形態(tài)特定的三維外形高表面積和合

22、適的表面理化性質與植入部位組織力學性能相匹配的結構強度,組織工程支架的來源,支架材料天然高分子材料合成降解聚合物生物陶瓷生物復合材料,不同形態(tài)結構的組織工程生物材料,天然高分子材料,蛋白質支架膠原明膠多糖支架海藻酸鹽殼聚糖透明質酸蛋白質－多糖支架,合成聚合物材料,聚丙烯酸及其衍生物聚乙二醇及其共聚物 聚乙烯醇聚交酯聚乳酸（PLA）聚（D,L-乳酸-co-乙醇酸）（PLGA）聚乙交酯（PGA）等,支架設

23、計及制備技術,生物陶瓷,磷酸鈣陶瓷聚磷酸鈣羥基磷灰石珊瑚（碳酸鈣）,支架設計及制備技術,成骨細胞良好地粘附于殼聚糖 - 明膠 / 羥基磷灰石支架上，生長狀態(tài)良好，分泌大量細胞外基質。,（3）生長因子,表皮生長因子：是對上皮細胞增殖有很強促進作用的53個氨基酸殘基的多肽。神經(jīng)生長因子：為神經(jīng)細胞特異性分泌的營養(yǎng)蛋白。肝細胞生長因子：為728個氨基酸殘基單鏈組成。骨形態(tài)發(fā)生蛋白：能誘導或刺激新骨的生成。,4.技術路線,體外得到工