輸血科常用實(shí)驗(yàn)及工作體會(huì)

1、輸血科常用實(shí)驗(yàn)及工作體會(huì),山東省立醫(yī)院輸血科 王 玉 芝,前 言,血型鑒定、交叉配血、抗體篩選試驗(yàn)是輸血科目前最常用的試驗(yàn)，也是每個(gè)輸血工作者應(yīng)該熟練掌握的試驗(yàn)，根據(jù)工作經(jīng)驗(yàn)我們認(rèn)為在試驗(yàn)過程中一些細(xì)節(jié)容易被忽略，值得注意，現(xiàn)將工作中的一些體會(huì)與大家一起探討交流，請(qǐng)大家提出寶貴意見。,ABO血型鑒定,1、鑒定原理：根據(jù)紅細(xì)胞上有無(wú)A抗原或(和)B抗原及血清中有無(wú)相應(yīng)抗體將血型

2、分為A型、B型、AB型和O型四種 正定型（細(xì)胞定型） 反定型（血清定型）2、方法：試管法、微柱凝膠法、玻片法均為凝集試驗(yàn),ABO血型鑒定（試管法）,1、試驗(yàn)材料：正定試劑：抗-A、抗-B（是否質(zhì)控？質(zhì)控要求？記錄？）抗-AB 確認(rèn)弱A、B抗原，與弱A、B抗原親 和力強(qiáng),會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)反應(yīng)?？?H 用于檢查亞型及孟買型?？?A1 用于A亞型檢測(cè)。,ABO血型鑒定（試管法）,反定試劑A1細(xì)胞（為什么

3、？）、B細(xì)胞，自制細(xì)胞的質(zhì)控 O細(xì)胞 檢查是否存在ABO系統(tǒng)以外抗體干擾ABO反定型。自身對(duì)照 用于確認(rèn)正反定型結(jié)果的有 效性,排除自身抗體對(duì)定型的干擾(如冷凝集等)。A2細(xì)胞 用于A亞型的鑒定（有些A亞型產(chǎn)生抗-A1抗體而不產(chǎn)生抗A2）。,ABO血型鑒定（試管法）,2、試驗(yàn)方法：正定：1滴2~5%被檢者紅細(xì)胞+1~2滴標(biāo)準(zhǔn)血清混勻，3400 轉(zhuǎn)15秒（轉(zhuǎn)速的選擇）反定：2滴受檢者血清+1滴標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞混勻離心,ABO血

4、型鑒定（試管法）,3、結(jié)果判定：搖動(dòng)力度，細(xì)胞扣邊緣情況，弱凝集的判斷（亞型尤其重要）正定預(yù)期結(jié)果3+~4+，如果出現(xiàn)弱凝集應(yīng)該考慮是抗原減弱還是亞型，不能輕易錯(cuò)過。血型判定并記錄正反不一致的思考與解決？關(guān)鍵在于認(rèn)識(shí)發(fā)現(xiàn)問題,ABO血型鑒定（試管法）,4、正反不一致的原因分析實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)操作錯(cuò)誤紅細(xì)胞標(biāo)本的相關(guān)問題血清標(biāo)本的相關(guān)問題,ABO血型鑒定（試管法）,技術(shù)操作錯(cuò)誤試劑濃度與配比，一般問題不大，但是比例不合適可能

5、漏檢亞型忘記加試劑，試劑工作中有可能出現(xiàn)結(jié)果判定，尤其對(duì)溶血結(jié)果的認(rèn)識(shí)，如果是血清標(biāo)本可能遇到，56度破壞補(bǔ)體驗(yàn)證記錄錯(cuò)誤，實(shí)際工作中對(duì)于錯(cuò)誤報(bào)告占很大比例標(biāo)本錯(cuò)誤,ABO血型鑒定（試管法）,紅細(xì)胞問題：ABO亞型！使正定凝集較弱，也是發(fā)現(xiàn)亞型的關(guān)鍵所在白血病或其它惡性疾病使患者紅細(xì)胞的A、B抗原減弱??！患者近期輸入了ABO不同型紅細(xì)胞，或ABO不同型的骨髓移植，可能出現(xiàn)混合視野。紅細(xì)胞獲得性或遺傳性異常，如獲得性B抗原

6、、T/Tn多凝集紅細(xì)胞。某些疾病（如腹腔癌）導(dǎo)致血漿中存在大量的型物質(zhì)，中和抗-A或抗-B抗體，引起正定型為假陰性或弱陽(yáng)性?；颊哐逯械母咝r(jià)自身冷凝集素使紅細(xì)胞發(fā)生凝集！！,ABO血型鑒定（試管法）,血清標(biāo)本相關(guān)問題新生兒抗體陰性或很弱、老年人抗體減弱??！白血病、淋巴瘤及使用免疫抑制劑的患者、先天丙種球蛋白缺乏的患者、免疫缺陷的患者抗體減弱??！ABO不同型骨髓移植患者。使用血漿或凝固不完全的血清會(huì)形成很小的纖維蛋白凝集的紅

7、細(xì)胞凝塊?。』颊哐逯杏胁灰?guī)則抗體或自身冷凝集素?。∧承┘膊。ǘ喟l(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、何杰金淋巴瘤等）導(dǎo)致球蛋白水平增高，引起緡錢狀凝集；纖維蛋白原水平增高，會(huì)引起緡錢狀凝集；血漿增容劑（葡聚糖、PVP）也會(huì)引起緡錢狀凝集導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。,ABO血型鑒定（試管法）,5、正反不符處理程序：患者的年齡患者的病史患者的近期輸血史患者的近期用藥史患者是否進(jìn)行了骨髓移植患者以前的血型家系調(diào)查處理細(xì)胞、血清、改變?cè)囼?yàn)條件增加

8、試驗(yàn)（洗滌細(xì)胞、改變比例、反應(yīng)溫度、吸收放散、血型物質(zhì)測(cè)定）,ABO血型鑒定（試管法）,常見問題解決ABO亞型正定：抗-A、抗-B、抗-AB、抗-A1、抗-H反定：A1c、A2c、Bc、Oc、自身對(duì)照吸收放散唾液型物質(zhì)檢測(cè)有條件者可作家系調(diào)查,ABO血型鑒定（試管法）,A、B抗原減弱延長(zhǎng)孵育時(shí)間、4℃孵育酶處理紅細(xì)胞吸收放散唾液型物質(zhì)檢測(cè)既往血型調(diào)查,ABO血型鑒定（試管法）,抗體減弱延長(zhǎng)孵育時(shí)間、4℃孵育加大

9、血清用量（很實(shí)用)既往血型調(diào)查酶處理試劑紅細(xì)胞,ABO血型鑒定（試管法）,冷自身抗體將血清和紅細(xì)胞分別在37孵育后再混合用37℃溫鹽水洗滌紅細(xì)胞、45℃熱放散3分鐘巰基試劑(DTT)處理紅細(xì)胞自身吸收去除血清中的自身冷抗體,ABO血型鑒定（試管法）,室溫反應(yīng)的同種抗體用譜細(xì)胞做抗體鑒定選擇沒有相應(yīng)抗原的A、B細(xì)胞做反定型,ABO血型鑒定（微柱法）,1、原理：是生物化學(xué)凝膠過濾技術(shù)和免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合的產(chǎn)物，通過調(diào)節(jié)

10、凝膠的濃度來(lái)控制凝膠間隙的大小。使其間隙只能允許游離的R BC通過，從而使游離RBC與聚集RBC分離。如果通過離心RBC沉積在凝膠管底部，則表明RBC未發(fā)生凝聚凝集，是陰性反應(yīng)， 若RBC聚集在凝膠帶上部，則表明RBC發(fā)生凝集，呈陽(yáng)性反應(yīng)。其本質(zhì)仍是凝集試驗(yàn)（凝膠可能不同，長(zhǎng)春為葡聚糖。）基本概念：特異性膠、中性膠、抗人球蛋白試劑膠,ABO血型鑒定（微柱法）,2、試驗(yàn)材料：比較單一，都是商品化，定量加樣，注意細(xì)胞濃度0.8%3、操

11、作：正定 反定（加樣順序）4、結(jié)果判定：按說明，凝集強(qiáng)度判斷，注意混合視野的判定，弱凝集的判定5、注意事項(xiàng)：細(xì)胞濃度，試劑一定室溫平衡，最好室溫反應(yīng)15分鐘再離心以增強(qiáng)弱反強(qiáng)度（衛(wèi)生部2008第1批質(zhì)控出現(xiàn)的問題，有2個(gè)標(biāo)本反定正確率60%）,ABO血型鑒定（微柱法）,6、假陽(yáng)性反應(yīng)可見于：（1）未完全除去纖維蛋白原的不完全血清標(biāo)本，殘存纖維蛋白原在凝膠中成為纖維蛋白，阻礙紅細(xì)胞沉淀而浮于膠中或膠表面。（我們收到衛(wèi)生部2、3批質(zhì)

12、控標(biāo)本有此現(xiàn)象） （２）被檢標(biāo)本染菌也使紅細(xì)胞浮于膠中或膠表面。（3）被檢紅細(xì)胞破碎，常管底及近底部一側(cè)，而不是在管底尖部。此為離心時(shí)微柱管離心力方向和該微管軸向方向不一致，本應(yīng)為陰性結(jié)果的沉淀位置偏離而呈似弱陽(yáng)性是因?yàn)榧t細(xì)胞陳舊，此時(shí)即使應(yīng)該是陰性結(jié)果，但破碎紅細(xì)胞膜沉于膠中或膠面呈弱陽(yáng)性。（4）實(shí)驗(yàn)室溫度低時(shí)，因凝膠顆?；顒?dòng)性減少，單個(gè)細(xì)胞穿過時(shí)困難，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。,ABO血型鑒定（微柱法）,（5）鐮刀形紅細(xì)胞貧血病

13、人在做血型配血時(shí)易出現(xiàn)假陽(yáng)性：正常的紅細(xì)胞有一定的變形性，可以通過小于其直徑的凝膠間隙，而鐮形紅細(xì)胞貧血的病人紅細(xì)胞變形能力降低，剛性增大，不能透 過凝膠間隙，故出現(xiàn)假陽(yáng)性。（6）嚴(yán)重感染的病人易出現(xiàn)假陽(yáng)性： 病人血清或血漿中的白細(xì)胞過多，堵塞了凝膠間隙，從而影響了紅細(xì)胞的沉降，造成假陽(yáng)性。（曾遇到一例）,ABO血型鑒定（微柱法）,7、假陰性反應(yīng)：（1）抗體過少、弱。（2）抗原、抗體比例不合適。注意：不是一個(gè)實(shí)驗(yàn)方法可以檢測(cè)

14、出所有抗原抗體反應(yīng)。,ABO血型鑒定,總結(jié)注意弱反應(yīng)（尤其是正定，一般應(yīng)該很強(qiáng)）發(fā)現(xiàn)正反不一致，不能輕易錯(cuò)過，慎用假陽(yáng)性解釋，可重復(fù)試驗(yàn)有問題的做好記錄，解決方案，不斷總結(jié)不同試驗(yàn)方法結(jié)合，試管與微柱各有優(yōu)缺點(diǎn)發(fā)現(xiàn)問題是關(guān)鍵，由于每個(gè)醫(yī)院情況不同，大部分醫(yī)院試劑不全，不能準(zhǔn)確判斷其亞型，但是應(yīng)該具備發(fā)現(xiàn)亞型的能力.,RH血型鑒定,1、原理：根據(jù)是否具有D抗原區(qū)分Rh陰陽(yáng)性2、試劑：IgM;IgG+IgM3、操作及結(jié)果解釋

15、試劑選擇及陰性確認(rèn)問題?。≡噭┻x擇：輸血科可以選擇IgM試劑Rh陰性確認(rèn)：輸血科與血站對(duì)陰性標(biāo)本的處理不同，輸血科對(duì)陰性標(biāo)本不必再進(jìn)一步確認(rèn)，以防弱D或部分D患者輸入Rh陽(yáng)性血；血站必須對(duì)RH陰性標(biāo)本確認(rèn)，以防弱D過部分D血液輸給Rh陰性患者。,交叉配血,常用方法 鹽水：發(fā)現(xiàn)IgM抗體 凝聚胺、微柱凝膠、酶法：發(fā)現(xiàn)IgG型不規(guī) 則抗體,交叉配血（凝聚胺）,原理：（略）操作：（是否質(zhì)控？記錄？）試劑用量:假凝集消

16、除液不能輕易多加，可能會(huì)造成假陰性反應(yīng)時(shí)間：加凝聚胺試劑后不可立即離心，應(yīng)使其充分反應(yīng)觀察時(shí)間：一分鐘之內(nèi)觀察結(jié)果影響因素：抗凝劑的影響（反定凝集較差可能受到抗凝劑影響，可以多加凝聚胺試劑凝集較好）、細(xì)胞濃度不可太濃,交叉配血（微柱凝膠）,原理：屬于經(jīng)典的抗人球蛋白試驗(yàn)操作：50微升0.8%紅細(xì)胞+25微升血清或血漿（根據(jù)廠家說明）結(jié)果判斷：不能錯(cuò)過弱凝集，如果有懷疑可以重復(fù)試驗(yàn)，注意：標(biāo)本最好抗凝、離心以消除纖維蛋白帶來(lái)的

17、干擾,交叉配血（微柱凝膠）,凝聚胺與微柱凝膠法兩種方法的差異：微柱法相對(duì)敏感，但不是萬(wàn)能的，有些抗體可能凝聚胺更敏感（如Rh抗體），實(shí)際工作很難發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，可能與工作人員的熟練程度有關(guān)，不管任何一種方法配血不合均不能發(fā)血。,抗體篩選（微柱法）,操作及結(jié)果判斷（略）抗體篩選陽(yáng)性結(jié)果的處理：最好作抗體鑒定，有些稀有抗體配血成功率極低可以尋求幫助，一般醫(yī)院可能無(wú)此條件用微柱法和凝聚胺兩種方法同時(shí)配血或者用微柱凝膠法配血，絕對(duì)不可以單純用

18、凝聚胺配血（方法的差異可能漏檢）,問題討論：1、微柱法抗體篩選弱陽(yáng)性，遇配血不合標(biāo)本是否也應(yīng)為弱陽(yáng)性？（劑量效應(yīng)以及紅細(xì)胞的新鮮度的影響）2、微柱法抗體篩選陽(yáng)性，選擇3袋微柱法配血均相合是否說明抗體篩選為假陽(yáng)性？3、微柱法抗體篩選陽(yáng)性，是否可用凝聚胺法直接配血選擇相合血液？,發(fā)現(xiàn)B(A)血型1例,試管法正定AB，A抗原弱于B抗原，但是結(jié)果明顯微柱法正反定型，正反定型相符為B型，抗A抗體很強(qiáng)與正?？笰無(wú)差異，懷疑初檢血型錯(cuò)誤試管

19、法正反定型復(fù)檢：正定AB，反定B型，懷疑特殊血型或標(biāo)本問題保險(xiǎn)起見重抽標(biāo)本，結(jié)果相同懷疑A亞型B，產(chǎn)生抗A（以上試驗(yàn)我科完成）省血液中心送檢，報(bào)告A2B,發(fā)現(xiàn)B(A)血型1例,我科隨后進(jìn)行以下試驗(yàn)：父母血型鑒定：父親：O 母親：與女兒血型表現(xiàn)一致，初步判為 cisAB根據(jù)資料一般cisAB為A強(qiáng)B弱，產(chǎn)生抗B，而此例A弱B強(qiáng)產(chǎn)生抗A，與B(A)血型表現(xiàn)一致，高度懷疑B(A)無(wú)法確認(rèn)，送上海血液中心進(jìn)行血清血及分子生物學(xué)

20、確認(rèn),上海血液中心鑒定結(jié)果,ABO正定抗-A 抗B 抗A1 人源抗A 人源抗B 2+ 4+W - 1+ 4+W說明確實(shí)存在A、B抗原ABO反定：A1細(xì)胞 B細(xì)胞 O細(xì)胞 A2細(xì)胞（6滴） 3+S - - 1+W說明確實(shí)存在抗-A，且與A1

21、、A2細(xì)胞同時(shí)凝集抗-H： O細(xì)胞 B細(xì)胞 患者細(xì)胞 2+S 1+W 2+說明 抗H增強(qiáng),上海血液中心鑒定結(jié)果,結(jié)論：患者存在AB抗原，且A弱B強(qiáng)；血清中存在抗A，同時(shí)和A1、A2細(xì)胞凝集；抗-H增強(qiáng)，符合B(A)特點(diǎn)鑒定為：B（A）血型為了進(jìn)一步證實(shí)進(jìn)行基因測(cè)序結(jié)論為640堿基變異，A被G取代為B（A）*04型,B(A)血型血清學(xué)特點(diǎn),B(A)血

22、型血清學(xué)特點(diǎn)：同時(shí)存在AB抗原，A弱B強(qiáng)一般鑒定為A亞型B，但是存在抗A同時(shí)和A1A2細(xì)胞凝集，和一般A亞型B不同，一般A亞型B產(chǎn)生抗A1，僅和A1細(xì)胞凝集，且H抗原相對(duì)與B不增強(qiáng)，因A亞型B有正常的B抗原分子生物學(xué)特點(diǎn)：PCR方法具有B基因和O基因，為遺傳學(xué)的B型；基因測(cè)序B基因基礎(chǔ)上發(fā)生堿基突變，使其具有部分A基因特性，因此也產(chǎn)生A抗原。目前總共發(fā)現(xiàn)5個(gè)B（A）血型，04、05均為上海血液中心05年發(fā)現(xiàn)，其基因序列被收錄入Gen