不可培養(yǎng)微生物研究進(jìn)展

1、不可培養(yǎng)微生物研究進(jìn)展,第四組 主講人：組員：,不可培養(yǎng)微生物的概念,Colwell 實(shí)驗(yàn)室在1982年提出活的但不可培養(yǎng)微生物的概念，他們發(fā)現(xiàn)將霍亂弧菌和大腸埃希菌（簡(jiǎn)稱大腸桿菌）轉(zhuǎn)到不含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的鹽水中，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的低溫保存，細(xì)菌會(huì)進(jìn)入一種數(shù)量不減、有代謝活力、但在正常試驗(yàn)室培養(yǎng)條件下不能生長(zhǎng)產(chǎn)生菌落的狀態(tài)，稱為活的但不能培養(yǎng)（viable but nonculturable, VBNC）狀態(tài)。 其后對(duì)多種屬細(xì)

2、菌進(jìn)行試驗(yàn)證明，這種不可培養(yǎng)狀態(tài)是普遍存在的。自然界中也廣泛存在著這種活的但不可培養(yǎng)微生物，在各種生境中僅有小部分的微生物可用實(shí)驗(yàn)室方法分離培養(yǎng)，而未被培養(yǎng)的種類卻代表了巨大的多樣性。,,嚴(yán)格說(shuō)來(lái), 這個(gè)概念并不嚴(yán)謹(jǐn)。所謂不可培養(yǎng), 其實(shí)應(yīng)該是在當(dāng)前認(rèn)識(shí)水平或?qū)嶒?yàn)條件下的不可培養(yǎng)。實(shí)際上, 通過(guò)合適的培養(yǎng)方法, 某些細(xì)菌是可以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)的。 例如在培養(yǎng)基中加人降解過(guò)氧化氫的過(guò)氧化氫酶或者非酶類的降解物如丙酮酸鈉等, 可

3、以使處于不可培養(yǎng)狀態(tài)的大腸桿菌恢復(fù)培養(yǎng)〕。又比如, 一種滕黃色微球菌的自分泌生長(zhǎng)因子討以皮摩爾濃度加人到培養(yǎng)基中, 可以提高從腹腔巨噬細(xì)胞裂解物中分離感染的結(jié)核分枝桿菌的比率其中有部分是不可培養(yǎng)的。Joseph等發(fā)現(xiàn), 通過(guò)改進(jìn)一些簡(jiǎn)單的培養(yǎng)方法, 就可以使實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)土壤細(xì)菌的種類和數(shù)量得到很大的提高。,VBNC細(xì)菌的分類,常見(jiàn)的一般情況下實(shí)驗(yàn)室條件可以培養(yǎng)的細(xì)菌,如霍亂弧菌等, 它們?cè)谀承l件下能夠進(jìn)人不可培養(yǎng)狀態(tài)。是對(duì)人工培養(yǎng)有

4、特殊要求的微生物, 當(dāng)改變培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)、時(shí)間和物理環(huán)境, 可以培養(yǎng)的微生物。后者通過(guò)提取環(huán)境樣品中總DNA, 構(gòu)建多元性基因庫(kù), 對(duì)16S rRNA 序列分析檢測(cè)基因來(lái)源。,不可培養(yǎng)微生物的研究進(jìn)展,隨著分子生物學(xué)、基因工程學(xué)的發(fā)展, 為環(huán)境中不可培養(yǎng)的微生物的研究提供了更多新的方法和思路。本文主要從經(jīng)誘導(dǎo)進(jìn)入VBNC 狀態(tài)的細(xì)菌的生物學(xué)特性、出現(xiàn)條件及檢測(cè)方法等方面, 對(duì)VBNC 細(xì)菌研究進(jìn)展做一綜述。,一、細(xì)菌VBNC的誘導(dǎo)因素,在自

5、然環(huán)境中, 細(xì)菌多處于長(zhǎng)期的饑餓狀態(tài)，而進(jìn)入VBNC 狀態(tài)可以增強(qiáng)細(xì)菌在寡營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中的存活能力。 當(dāng)細(xì)菌進(jìn)人不可培養(yǎng)狀態(tài)后, 與其正常培養(yǎng)狀態(tài)菌體比較, 對(duì)于高溫、高鹽以及酸性環(huán)境等不利條件有更強(qiáng)的抵抗力, 說(shuō)明某些細(xì)菌的不可培養(yǎng)狀態(tài)是對(duì)不利環(huán)境的一種適應(yīng), 有利于細(xì)菌在不利環(huán)境中生存。,,細(xì)菌VBNC誘導(dǎo)的具體例子： 低營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)的VBNC 細(xì)胞有霍亂弧菌、痢疾志賀菌、腸球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)

6、菌等。P. Mary等[ 3] 研究了進(jìn)入VBNC 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)條件,把氣單胞菌放在4 ! 的寡營(yíng)養(yǎng)的無(wú)菌蒸餾水中7周則觀察不到可培養(yǎng)菌落的數(shù)量, 這表明已經(jīng)進(jìn)入到了VBNC 狀態(tài)。如果在25 ! 培養(yǎng)10 周以上, 有活力的細(xì)胞的數(shù)量降低到了0. 8對(duì)數(shù)單位,這時(shí)細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)入到了經(jīng)典饑餓狀態(tài), 可以觀察到縮成球形的VBNC 細(xì)胞。大多數(shù)文獻(xiàn)資料顯示, 溫度是誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入VBNC 狀態(tài)最重要的因子, 而且溫度常和寡養(yǎng)條件協(xié)同作用。S. M

7、. N el􀀁son等[ 4] 研究表明, 在只提供少量氮源、無(wú)碳源的情況下E. coli在5 ! 培養(yǎng)1 000 h 可進(jìn)入VBNC狀態(tài), 通過(guò)各種方法測(cè)定的特定溫度下的菌落數(shù)的結(jié)果是一致的。溫度誘導(dǎo)的VBNC細(xì)胞有軍團(tuán)桿菌、創(chuàng)傷弧菌等。N aC l對(duì)多數(shù)腸道菌的生長(zhǎng)影響較大, 徐懷恕等[ 1] 發(fā)現(xiàn)E. coli在25% N aC l環(huán)境中培養(yǎng)96 h 比在5% N aC l下培養(yǎng)同樣時(shí)間進(jìn)入VBNC狀態(tài)的細(xì)菌數(shù)目

8、高出40倍之多。此外, 氧化、滲透壓等因素也可以誘發(fā)VBNC 狀態(tài)的出現(xiàn)。鏈縮短, 青霉素結(jié)合蛋白在VBNC 階段消失。Tho lozan[ 8] 發(fā)現(xiàn), Campy lobacter jejuni 進(jìn)入VBNC狀態(tài)后膜內(nèi)外pH 梯度、膜內(nèi)K+ 濃度和膜勢(shì)能均降低, ATP及ADP濃度降低, 30 d后僅能檢測(cè)到AMP存在。,二、細(xì)菌VBNC狀態(tài)的生物學(xué)特性,1、VBNC細(xì)菌的形態(tài) 細(xì)菌進(jìn)入VBNC 狀態(tài)后形態(tài)會(huì)發(fā)生改

9、變, 大多數(shù)的桿菌和弧菌進(jìn)入VBNC 狀態(tài)后會(huì)縮成球狀, 特別是G- 桿菌表現(xiàn)尤為明顯。S ignoretto等[ 5] 研究VBNC 狀態(tài)的G- 菌糞腸球菌( Entero􀀁coccus faecalis)的形態(tài)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)其不但沒(méi)變小,反而有輕微的伸長(zhǎng)。,,2、VBNC細(xì)菌的生理、生化特性 細(xì)菌進(jìn)入VBNC 狀態(tài)后, 菌體對(duì)底物利用減少, 核糖體及染色質(zhì)等物質(zhì)密度明顯降低, 細(xì)胞質(zhì)濃縮, 蛋白質(zhì)和

10、脂質(zhì)總量下降。Sco ttA R ice等[ 6]對(duì)Vibrio vulnif icus 的核酸分析表明, 進(jìn)入VBNC狀態(tài)的細(xì)胞最初具有完整的DNA 和RNA, 并具有可恢復(fù)正常狀態(tài)的能力。隨著保持VBNC 狀態(tài)的時(shí)間增長(zhǎng), 核酸不斷降解, 其中部分細(xì)胞已經(jīng)不具備恢復(fù)正常狀態(tài)的能力。Caterina S ignoretto等[ 7] 分析了E. coli KN126的肽聚糖化學(xué)組成的變化, 表明二氨基庚二酸交聯(lián)度( DAPИ

11、577;DAP)增加了2倍, 胞壁肽共價(jià)結(jié)合脂蛋白的量增加, 肽聚糖鏈縮短, 青霉素結(jié)合蛋白在VBNC 階段消失。Tho lozan[ 8] 發(fā)現(xiàn), Campy lobacter jejuni 進(jìn)入VBNC狀態(tài)后膜內(nèi)外pH 梯度、膜內(nèi)K+ 濃度和膜勢(shì)能均降低, ATP及ADP濃度降低, 30 d后僅能檢測(cè)到AMP存在。,,3、VBNC細(xì)菌的致病性 研究表明, 病原微生物進(jìn)入VBNC 狀態(tài)并不代表它們失去致病能力。C

12、o lw ell等[ 9] 證實(shí), 注射VBNC狀態(tài)的Vibrio cholerae仍能導(dǎo)致測(cè)試人員腹瀉, 同時(shí)發(fā)現(xiàn)此菌在進(jìn)入VBNC 狀態(tài)28 d 后, 仍能產(chǎn)生霍亂毒素, PCR 檢測(cè)說(shuō)明產(chǎn)生霍亂毒素的基因仍然存在。W. Ba ffone 等[ 10] 將進(jìn)入VBNC狀態(tài)的Vibrio parahaemoly ticus ATCC 43996 注入Ba lb / c小鼠腸管內(nèi)結(jié)扎, 分別在第2、4、8和12天解剖2只小鼠進(jìn)行尸檢,

13、結(jié)果表明50% 的小鼠被感染。Rahman、M. H abibur等[ 11] 將VBNC 狀態(tài)的Aeromonas hydrophila 注入金魚(yú)體內(nèi), 發(fā)現(xiàn)VBNC 狀態(tài)下細(xì)菌仍能感染金魚(yú), 但毒性較弱。VBNC狀態(tài)的致病菌大多保有毒性, 只是隨著進(jìn)入VBNC 的時(shí)間延長(zhǎng), 其感染性減弱, 但是由于VBNC致病菌很難檢測(cè)和防御, 因此需要進(jìn)一步的研究?？偨Y(jié)了已報(bào)道的進(jìn)入VBNC的致病菌的種類及其誘導(dǎo)因素, 見(jiàn)下表。,,已報(bào)道的進(jìn)入V

14、BNC 狀態(tài)的致病菌的種類及誘導(dǎo)因素細(xì)菌種類􀀁 􀀁 􀀁 􀀁 誘導(dǎo)因素􀀁 􀀁 􀀁 􀀁腸炎沙門(mén)菌(S almonellaen teritid is)

15、 溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏傷寒沙門(mén)菌(S. typhi ) 營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏鼠傷寒沙門(mén)菌(S. typhimurium ) 溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏、可見(jiàn)光、鹽度痢疾志賀菌(Sh ig elladysen teriae )

16、 溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏福氏志賀菌(S . f lexneri) -----------宋內(nèi)志賀菌(S. sonnei ) -----------霍亂弧菌( V. chole

17、rae ) 溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏、滲透壓副溶血弧菌( V. parahaemoly ticu s) 溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏創(chuàng)傷弧菌( V. vu ln if icu s ( typ es1& 2) ) 溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏、鹽度腸出

18、血性大腸埃希菌( EHEC) 溫度、可見(jiàn)光、紫外線、鹽度、滲透壓、腐殖酸空腸彎曲菌(C. jejuni ) 溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏、曝氣、高壓氧幽門(mén)螺桿菌(H el icobacterpy lori) 溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏肺炎克雷伯菌(K lebsiella pn

19、eum on ia e) 營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏單核細(xì)胞增生李斯特菌(L isteriamonocytog en es) ----------嗜肺軍團(tuán)菌(L eg ionel lapn eum oph ila ) 溫度、殺生素、生物因子結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tubercu

20、 losis) ----------銅綠假單胞菌(P seud om onasaerug in osa ) 溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏,,4、復(fù)蘇 VBNC狀態(tài)作為細(xì)菌的一種存活機(jī)制, 應(yīng)該具有再次復(fù)蘇為可培養(yǎng)狀態(tài)的能力。O liver 和Co llw ell等[ 12 ] 在濾膜圍隔(濾膜漫射圍隔實(shí)驗(yàn))中接種細(xì)菌后分別置于

21、河口或近海水體中, 定期取樣檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)低溫時(shí)細(xì)菌快速進(jìn)入VBNC 狀態(tài), 而VBNC細(xì)菌在較高溫度下則迅速恢復(fù)到完全可培養(yǎng)狀態(tài)( 24 h內(nèi))。H in􀀁chung Wong等[ 13] 研究了在低鹽培養(yǎng)基上Vibrio p arahaemoly ticus 的復(fù)蘇,表明MMS􀀁0. 5%的NaC l培養(yǎng)基抑制細(xì)胞的增殖,但是當(dāng)把溫度設(shè)定為25 ! 而不是37 ! 時(shí), Vibrioparahaem

22、olyticus可以成功復(fù)蘇。Matthew J. H ig􀀁gins等[ 14] 用定量PCR 的方法測(cè)定在消化和脫水的不同階段大腸埃希菌數(shù)目變化的情況, 證實(shí)部分VBNC 菌株恢復(fù)了可培養(yǎng)的特性。Mukamalova等[ 15􀀁16 ] 對(duì)M icrococcus luteus 分泌的一種蛋白( Rpf)進(jìn)行了研究, Rpf可以在低濃度的培養(yǎng)基上形成, 促進(jìn)菌體的復(fù)蘇。,三、VBNC的檢測(cè)方法,V

23、BNC細(xì)菌的檢測(cè)包括總菌數(shù)檢測(cè)、活菌數(shù)檢測(cè)和可培養(yǎng)活菌數(shù)檢測(cè), 因?yàn)橹挥锌膳囵B(yǎng)菌數(shù)為零而活菌數(shù)不為零的細(xì)胞才可以判斷它進(jìn)入了VBNC狀態(tài)。目前報(bào)道的VBNC的檢測(cè)方法主要有經(jīng)典方法、分子生物學(xué)方法、呼吸檢測(cè)法、死/活菌檢測(cè)試劑盒、熒光抗體染色法( FAC )、放射自顯影技術(shù)等。經(jīng)典方法是指吖啶橙染色熒光直接計(jì)數(shù)法(AODC )、活菌直接鏡檢法( DVC )和平板直接計(jì)數(shù)法(HPC )。,,1、吖啶橙染色計(jì)數(shù)法(AODC)

24、 對(duì)VBNC 細(xì)菌的計(jì)數(shù), 目前最常用的方法是吖啶橙染色計(jì)數(shù)法。其原理是吖啶橙可以使完整的雙鏈DNA 發(fā)綠色熒光, 使斷裂的單鏈DNA 發(fā)橘紅色熒光, 并且能使染色的細(xì)胞與背景分開(kāi)。但是這種方法不能用來(lái)區(qū)分活菌和死菌, 一般只用做總菌計(jì)數(shù)。,,2、活菌直接計(jì)數(shù)法(DVC) 測(cè)定活性更具有說(shuō)服力的方法是活菌直接計(jì)數(shù)法。在培養(yǎng)基中添加少量酵母浸膏等營(yíng)養(yǎng)物和少量萘啶酮酸( DNA 合成抑制劑) 培養(yǎng)6 h,25 !

25、, DNA 復(fù)制被抑制, 細(xì)胞也不進(jìn)行分裂, 但是活菌可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成, 因此細(xì)胞會(huì)變長(zhǎng),這成為活細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志。然后用吖啶橙染色,在熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)[ 17] 。然而此法卻不適用于革蘭陽(yáng)性菌, 因?yàn)殛?yáng)性菌對(duì)萘啶酮酸有強(qiáng)烈的抵抗力, 這也是VBNC 研究尚未在陽(yáng)性菌中大量開(kāi)展的主要原因之一。目前改良DVC 法應(yīng)用具有DNA 多聚酶的抑制作用的藥物替代萘啶酮酸, 擴(kuò)大了細(xì)菌VBNC 狀態(tài)的研究范圍, B es􀀁n

26、ard[ 18] 就采用了環(huán)丙沙星, 有效地區(qū)別了李氏桿菌的死菌與活菌。,,3、間接免疫熒光抗體染色計(jì)數(shù)法( IFAT) 間接免疫熒光抗體染色計(jì)數(shù)法是通過(guò)抗血清加熒光抗體染色后, 使細(xì)胞與背景相區(qū)別, 然后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù), 進(jìn)入VBNC 狀態(tài)的細(xì)菌保持著和正常細(xì)菌一樣的表面抗原, 因此可以利用免疫技術(shù)對(duì)它們進(jìn)行檢測(cè)。徐懷恕等[ 19] 用間接免疫熒光抗體染色計(jì)數(shù)法檢測(cè)VBNC 的副溶血性弧菌。該法具有操作簡(jiǎn)便,

27、特異性強(qiáng), 重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。,,4、分子生物學(xué)方法 分子生物學(xué)技術(shù)是直接從樣品中提取總DNA, 中間沒(méi)有任何篩選性的過(guò)程, 因此所得DNA 能夠準(zhǔn)確地反映樣品中微生物的實(shí)際情況,包括基因探針、分子雜交和PCR 等, 可以檢查樣品中含量極微的總菌量。PCR 對(duì)于環(huán)境當(dāng)中細(xì)菌量較少的樣品比較有效。Koch 等[ 20] 曾經(jīng)用PCR 通過(guò)對(duì)粗的含菌底物的擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)10 g中含有一個(gè)霍亂弧菌的樣品。更早的時(shí)候, Shi

28、ra i等[ 21] 報(bào)道用PCR 的方法檢測(cè)糞便中的V. chol􀀁erae 01腸毒素操縱子。使用PCR 方法可以證明VBNC菌的存在, 也可以結(jié)合DVC和熒光標(biāo)記單克隆抗體的方法進(jìn)行檢測(cè)。,,5、放射自顯影方法 放射自顯影術(shù)用于檢測(cè)樣品中能進(jìn)行新陳代謝的活菌量。放射自顯影術(shù)其原理是將放射性同位素(如14 C 和3H )標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi),經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后, 將標(biāo)本制成切片或涂片, 涂上鹵化

29、銀乳膠, 經(jīng)一定時(shí)間的放射性曝光, 組織中的放射性即可使乳膠感光, 它是利用鹵化銀乳膠顯像檢查和測(cè)量放射性的一種方法。Shahama 等[ 22]使用3H 標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷, 對(duì)幽門(mén)螺桿菌在水環(huán)境中的存活情況進(jìn)行了研究, 通過(guò)放射性自顯影技術(shù), 證明20 ~ 30 d 內(nèi)幽門(mén)螺桿菌的VBNC細(xì)胞內(nèi)仍有放射性氚的摻入, 仍具有合成DNA 的活力。,,不可培養(yǎng)微生物有著廣闊的研究前景。 更多的微生物學(xué)家致力于VBNC