實時定量pcr技術(shù)應(yīng)用常見問題解答—abi

1、1.定量PCR儀的開關(guān)機順序是怎樣的？按照正確的開關(guān)機順序操作，有助于延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。開機順序：先開電腦，待電腦完全啟動后再開啟定量PCR儀主機，等主機面板上的綠燈亮后即可打開定量PCR的收集軟件，進行實驗。關(guān)機順序：確認實驗已經(jīng)結(jié)束后，首先關(guān)閉信號收集軟件，然后關(guān)掉定量PCR儀主機的電源，最后關(guān)閉電腦。2.哪些種類的反應(yīng)管和蓋子適合定量PCR實驗使用？有何需要注意的地方？定量PCR實驗可以使用以下耗材：96孔

2、光學反應(yīng)板配合光學膜，0.2ml光學八聯(lián)反應(yīng)管配合光學膜，0.2ml光學八聯(lián)反應(yīng)管配合平蓋的光學八聯(lián)管蓋。ABI公司生產(chǎn)的定量PCR耗材的具體使用方法和貨號見下表：3.為什么要定期對電腦進行磁盤碎片整理？怎樣整理？當運行實時定量PCR儀及使用軟件分析實驗結(jié)果時，計算機會刪除并創(chuàng)建若干文件，計算機硬盤的空閑空間會被分割成越來越多的小塊。當硬盤驅(qū)動器上文件以分解的碎片存儲時，程序需要更長的時間才能存取文件，因為必須多次尋找文件碎片以存取不同

3、的片斷。碎片整理實用程序?qū)⒁粋€文件分解開的多個碎片合并在一起，并存儲到硬盤的同一個位置，從而清除文件碎片，進而優(yōu)化系統(tǒng)性能。濕度：2080%；對于潮濕的省份，推薦實驗室配備除濕機。空間：易于操作，安全。7.怎樣判斷定量PCR儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染？一個辦法是運行背景校正反應(yīng)板，當一個或多個反應(yīng)孔連續(xù)顯示出不正常的高信號，則表明該孔可能被熒光污染物。另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執(zhí)行ROI的校正，當某個孔

4、的信號明顯高出其他孔時，則表明該孔被污染。清除樣本加熱塊污染的步驟如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每個污染的反應(yīng)孔中。吹打數(shù)次。將廢液吸入廢液杯中。重復以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。確認反應(yīng)孔中的殘留液體蒸發(fā)完8.什么是背景校正？多長時間執(zhí)行一次背景校正？背景校正程序測量定量PCR儀所使用的反應(yīng)管和水的空白熒光強度。在運行校正程序期間，定量PCR儀在10分鐘內(nèi)連續(xù)讀取背景校正板的熒光強度，信號收集的溫度為60C。隨后，SDS軟件計算

5、所收集到的熒光強度的平均值，提取結(jié)果并保存到校正文件中。軟件在今后的分析中將自動調(diào)用此校正文件，從實驗數(shù)據(jù)中扣除背景信號。因為背景熒光的信號強度隨著許多外界因素（比如外來的污染、反應(yīng)板反應(yīng)管的生產(chǎn)廠商不同、水的純度等）而變化，所以推薦定期進行背景校正，一般每三個月到半年校正一次。9.什么是純熒光校正？多長時間校正一次？純熒光校正是測定各種純熒光染料標準品的波長和信號強度，通俗地說是讓儀器“認識”各種熒光染料。軟件收集并儲存各種純熒光染料

6、標準品的熒光信息。以后每次定量實驗運行過程中，SDS軟件收集樣品的原始光譜信號，并將此原始光譜與純熒光文件中的數(shù)據(jù)進行比較，精確扣除不同染料的信號重疊部分，從而確定樣品中的熒光染料種類和信號強度。推薦每隔半年進行一次純熒光校正。在運行光譜校正之前，請先進行背景校正和ROI校正。10.96孔板怎樣封膜？當使用96孔板做實驗的時候，推薦使用光學膜代替蓋子來密封反應(yīng)孔。正確的封膜方法是：先沿著96孔板的縱向壓膜，然后橫向，最后沿著板的邊緣按壓