醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆沾姿崂w維薄膜電泳法分離蛋白質(zhì)的原理和方法二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在pH值小于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)為正離子，在電場(chǎng)中向陰極移動(dòng)；在pH值大于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)為負(fù)離子，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)。血清中含有數(shù)種蛋白質(zhì)，它們所具有的可解離基團(tuán)不同，在同一pH的溶液中，所帶凈電荷不同，故可利用電泳法將它們分離。血清中含有白蛋白、α球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白等，各種蛋白質(zhì)由

2、于氨基酸祖墳、立體構(gòu)象、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場(chǎng)中遷移速度不同。由表可知，血清中5種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的緩沖液中，它們都電離成負(fù)離子，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)。蛋白質(zhì)名稱(chēng)等電點(diǎn)相對(duì)分子質(zhì)量白蛋白4.8869000α1球蛋白5.06200000α2球蛋白5.06300000β球蛋白5.1290000~150000γ球蛋白6.85~7.50156000~300000在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的含量與結(jié)合

3、的燃染料量成正比，故可將蛋白質(zhì)區(qū)帶剪下，分別用0.4molLNaOH溶液浸洗下來(lái)，進(jìn)行比色，測(cè)定其相對(duì)含量。也可以將染色后的薄膜直接用光密度計(jì)掃描，測(cè)定其相對(duì)含量。腎病、彌漫性肝損害、肝硬化、原發(fā)性肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、慢性炎癥、妊娠等都可以使白蛋白下降。腎病時(shí)α1、α2、β球蛋白升高，γ球蛋白降低。肝硬化時(shí)α2、β球蛋白降低，而α1、γ球蛋白升高。三、實(shí)驗(yàn)器材1、醋酸纖維薄膜（2cm8cm，厚度120μm）2、人血清；3、燒杯及培養(yǎng)皿數(shù)

4、只；4、點(diǎn)樣器；5、竹鑷子；6、玻璃棒；7、電吹風(fēng)；8、試管六只；9、恒溫水浴鍋；10、電泳槽；11、直流穩(wěn)壓電泳儀；12、7220型分光光度計(jì)；13、剪刀四、實(shí)驗(yàn)試劑α1球蛋白比率==0.0491?A總Aα2球蛋白比率==0.0672?A總Aβ球蛋白比率==0.125?A總Aγ球蛋白比率==0.108?A總A七、實(shí)驗(yàn)討論與總結(jié)1、什么是血清將抽取的血液置入不加抗凝劑的試管中，使血凝固，析出的上清液就是血清。血清中所含的蛋白成分與血漿相

5、比，少了纖維蛋白原，而主要是白蛋白、球蛋白。2、由于蛋白的絕大部分均由肝臟合成，所以，各種蛋白質(zhì)的質(zhì)與量的變化，除與免疫性疾病等有關(guān)外，主要反映肝臟的生理、病理情況。3、醋酸纖維素薄膜醋酸纖維素（二乙酸纖維素）薄膜具有勻一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，是由醋酸纖維素加工制成的。醋酸纖維素薄膜作為是電泳支持體有以下優(yōu)點(diǎn)：①電泳后區(qū)帶界限清晰；②通電時(shí)間較短（二十分鐘至一小時(shí)）；③它對(duì)各種蛋白質(zhì)（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都幾乎完全不吸附，因此無(wú)

6、拖尾現(xiàn)象；④對(duì)染料也沒(méi)有吸附，因此不結(jié)合的染料能完全洗掉，無(wú)樣品處幾乎完全無(wú)色。它的電滲作用雖高但很均一，不影響樣品的分離效果，由于醋酸纖維素薄膜吸水量較低，因此必需在密閉的容器中進(jìn)行電泳，并使用較低有電流避免蒸發(fā)。醋酸纖維素薄膜經(jīng)14－二氧六環(huán)、透明液或液體石蠟處理即透明，因而可得背景為無(wú)色的電泳圖譜。4、血清提取蛋白從血清中提取的蛋白質(zhì)，適用于食品工業(yè)的食品添加劑和醫(yī)藥制劑。通常提取蛋白質(zhì)的方法是離心分離，除去血漿，使二價(jià)鐵血紅素酸

7、化，并將其排除。制作方法：取經(jīng)過(guò)穩(wěn)定的血液，作離心分離15～30分鐘，每分鐘轉(zhuǎn)速為2500～3000轉(zhuǎn)。從而取得固形物，去除血漿，用水使固形物沉渣溶解。置血紅素于培養(yǎng)基中。為了使培養(yǎng)基酸化而使血紅素分子中的二價(jià)鐵血紅素和血球蛋白的結(jié)合體分離預(yù)先制備好醋酸和氯化鈉的混合物并將它加熱到90～110℃?；旌蠒r(shí)將固形物的溶血產(chǎn)物緩慢地添加到加熱的混合物中。重新把溫度逐漸地升高到沸點(diǎn)，煮沸5～15分鐘，以便使結(jié)合體完全分離，接著將混合物逐步冷卻到

8、室溫。為了使二價(jià)鐵血紅素溶解并消除，在混合物中按溶物產(chǎn)物比值2∶1～5∶1添加乙醚。這時(shí)提取出來(lái)的蛋白質(zhì)呈白棉絮狀。將溶液過(guò)濾，再用乙醚清洗。100毫升血中提取的蛋白質(zhì)產(chǎn)品相當(dāng)于14.4克。應(yīng)用這種方法，每100毫升的血液可提高蛋白質(zhì)得率45%。5、實(shí)驗(yàn)總結(jié)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，γ球蛋白測(cè)得的含量偏低，原因可能是在裁剪電泳條帶的時(shí)候遺漏了一條薄膜沒(méi)有剪下浸洗，分析即γ球蛋白；另外實(shí)驗(yàn)室溫度比較低，電泳距離太短不利于觀察分析，應(yīng)增大電壓增長(zhǎng)電泳