醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)

1、,實驗六醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì),臨床生化實驗室,,一、實驗目的,1. 掌握電泳分離的蛋白質(zhì)的基本原理2. 熟悉醋酸纖維薄膜電泳技術(shù),二、實驗原理（一）,電泳：帶電粒子在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。電泳技術(shù): 利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達到分離的技術(shù)。,二、實驗原理（二）,蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。血清中各主要蛋白質(zhì)的等電點均低于pH7.0，在pH8.6的堿性緩沖液中，電離成負離子，在電場中向正極泳動。

2、因血清中各種蛋白質(zhì)的pI值不同，在同一pH緩沖液中帶電荷量會有不同，此外，各蛋白質(zhì)的分子大小和形狀也不一致，所以在同一電場中，各蛋白質(zhì)的電泳遷移率也不同。帶電荷多、分子量小者，泳動較快，反之則慢。,醋酸纖維薄膜電泳可將血清蛋白分成五條主要區(qū)帶，從正極端起依次為清蛋白/白蛋白Alb， α1-球蛋白，α2-球蛋白，β-球蛋白, γ-球蛋白。這些蛋白經(jīng)過染色處理，可展示出清晰的蛋白電泳圖譜。如下圖所示。,二、實驗原理（三）,由于染色時，染料

3、與蛋白質(zhì)的結(jié)合與蛋白質(zhì)的量成正比。因此可將實驗圖片掃描后，根據(jù)每個蛋白條帶的光密度，采用軟件計算每種蛋白質(zhì)的相對含量。也可將各蛋白區(qū)帶剪下，分別用一定量的NaOH稀溶液洗脫，進行比色，測出各蛋白質(zhì)區(qū)帶的相對含量。,二、實驗原理（四）,蛋白定量：,影響電泳的因素,,三、實驗器材,臥式電泳槽,DYY-2型電泳儀,醋酸纖維薄膜（CAM,2 cm×8cm）：1片/人。 染色缸1個，公用。 漂洗缸3個，公用。 點樣器：公用。

4、濾紙：公用。 鑷子：公用。,脫色搖床,掃描儀,四、實驗試劑,巴比妥-巴比妥鈉緩沖液（pH8.6，離子強度0.06） 染色液（麗春紅S染液） 漂洗液：3%（V/V）冰醋酸,迎著光辨別醋酸纖維薄膜（CAM）的光面和毛面。在毛面的一端1.5cm處，用直尺和鉛筆輕劃一橫線，做點樣標記，并用鉛筆標號。將已經(jīng)編號、標記的CAM膜以毛面朝下的方式浸入巴比妥緩沖液中，浸泡30 min。,五、實驗操作,實驗準備：1）醋酸纖維薄膜的準備,電泳裝

5、置由電泳槽和穩(wěn)壓電源兩部分組成，兩者之間有專門的連線連接。電泳槽的正負極各有一個裝緩沖液的槽，紅色為正極，黑色為負極。電泳槽置于水平臺，兩側(cè)注入等量的巴比妥緩沖液，使其在同一水平面。用雙層紗布搭橋。,2）電泳裝置的準備,1）用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的緩沖液，然后平鋪在桌子上（毛面朝上）。2）在一次性手套上滴一滴血清（3-5μl），用點樣器在血清上蘸一下，再將點樣器輕印在CAM膜的點樣線上，待血清完全滲透到薄膜內(nèi)

6、后移開。,2.點樣,1）將加樣后的薄膜，毛面向下，垂直架于電泳槽的游桿兩端，點樣端置于負極，紗布將膜的兩端與緩沖液連通2）將電泳槽的正極和負極分別與電泳儀的正極、負極連接，打開電源，低壓，平衡5min。調(diào)節(jié)電壓至90-150V (110V),穩(wěn)壓電泳45min。3）待電泳區(qū)帶展開約25-35mm后，關(guān)閉電源。,,,3.電泳,電泳完畢后，取出薄膜，以毛面朝下的方式浸于麗春紅S染色液中，染色5-10min。,,,4.染色,將染色過的薄膜

7、依次放在漂洗缸1,2,3中漂洗，每次5 min,5.漂洗,將漂洗好的CAM薄膜放置在濾紙上，吸干水分，放入掃描儀中進行掃描，并用軟件分析各種蛋白質(zhì)的相對含量。,,,6.定量,各組分蛋白%=AX/AT ×100% AX:各組分蛋白光密度值 AT:血清各組分蛋白光密度值之和,7.計算,薄膜的浸潤是電泳成敗的關(guān)鍵之一。 點樣時，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，但不宜太干。 點樣時，動作要輕

8、、穩(wěn)，用力不能太大。 電泳時應選擇合適的電壓，一般穩(wěn)壓在為110 V。 通電時，不得接觸槽內(nèi)的緩沖液或CAM，以防觸電。 電泳槽緩沖液的液面要保持一定的高度，同時電泳槽兩側(cè)的液面應保持在同一水平，否則，通過薄膜時有虹吸現(xiàn)象，影響蛋白分子的泳動速度。,六、注意事項,七、實驗結(jié)果,正常參考值,清蛋白57-68%a1-球蛋白1-5.7%a2-球蛋白1.12-4.9%β-球蛋白7-13%γ-球蛋白9.8-18.2%,

9、九、臨床意義,正常血清蛋白電泳一般可分為5條區(qū)帶，即Alb，α1，α2，β,γ球蛋白。1. 臍帶血清、胎兒血清、部分原發(fā)性肝癌血清在Alb和α1球蛋白之間可增加一條甲胎蛋白帶。2.M蛋白血癥 單克隆γ球蛋白（M蛋白）血癥，主要見于多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、重鏈病以及一些良性M蛋白增多癥。在β和γ球蛋白后區(qū)段的各部分出現(xiàn)一條致密濃集的M蛋白帶。3.蛋白缺乏癥 主要包括a1抗胰蛋白酶缺乏癥、γ球蛋白缺乏癥等。臨床上較少見，電泳圖

10、表現(xiàn)為a1或γ球蛋白缺乏或顯著降低。,異常的血清蛋白電泳可見以下疾病：,4.急慢性腎炎 表現(xiàn)為a1、a2、和β三種球蛋白均增高。5.腎病 見于急慢性腎炎、腎病綜合癥、腎衰竭等。表現(xiàn)為Alb降低、a2和β球蛋白升高。6.肝病 包括急慢性肝炎和肝硬化，主要表現(xiàn)為Alb降低， β和γ球蛋白增多，出現(xiàn)β和γ球蛋白難以分離而相連的“β-γ橋”，主要是因為IgA的增高所致。IgA與肝纖維化有關(guān)。,臨床意義,八、方法學評價,優(yōu)點：CAM電