腰椎間盤突出癥的血清蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、目的:腰椎間盤突出癥是一種引起下腰痛和坐骨神經(jīng)痛的常見骨科疾病。國內(nèi)外從細胞因子上及遺傳學上對椎間盤突出癥的機制的研究非常多，目前主要認為腰椎間盤突出癥是由于椎間盤物理因素改變引起一系列生物學反應，從而引起髓核細胞凋亡，繼而導致多因子功能改變而引起一系列表現(xiàn)。國內(nèi)外學者研究腰椎間盤突出癥多數(shù)從一兩個基因或者細胞因子著手，而腰椎間盤突出癥即是多因素協(xié)同作用的結果，因此，至今腰椎間盤突出癥的詳細機制目前尚不十分明了。蛋白質(zhì)組學的產(chǎn)生，使人們

2、能直接從蛋白質(zhì)表達水平上揭示細胞、組織的表達豐度及其功能，克服了以往在DNA或RNA水平研究基因表達的缺陷——基因表達與DNA或RNA改變的不對應性，進而能夠在細胞和生命有機體的整體水平闡明生命的本質(zhì)和疾病形成的機制。 在本研究應用蛋白質(zhì)組技術尋找椎間盤突出癥患者和正常人的血清差異蛋白，并應用酶聯(lián)免疫吸附試驗對差異表達進行進一步驗證。筆者希望所證實的差異蛋白能作為腰椎間盤突出癥的生物標志物以及成為該疾病靶向治療的位點。

3、材料與方法: 1、晨起空腹條件下采集腰椎間盤突出癥患者和健康志愿者靜脈血2ml，離心后收集血清，在每個樣本上加入蛋白酶抑制劑，然后分離血清樣本保存在—80℃?zhèn)溆谩?0微升血清樣本放入1mL的離心管里面，根據(jù)ProteoPrepBlueAlbumin&IgGDepletionKit(SIGMA)試劑盒和2-Dcleanupkit(AmershamBiosciences)試劑盒的說明分別用于清除樣本中的白蛋白與球蛋白和鹽與脂。然后利

4、用牛血清作為標準運用Bradford法測定濃度，下一步進行雙向電泳。 2、雙向電泳主要按照G(o)rg等方法和Bio—Rad儀器操作手冊進行。第一相等電聚焦(IEF)，血清的上樣量總體積為0.35ml，(含總蛋白質(zhì)0.3mg)。等電聚焦結束后，迅速取出IPG膠條，分別置于平衡液中各平衡15分鐘。預灌制好聚丙烯酰胺凝膠后，將平衡好的IPG膠條置于SDS膠面上，低熔點0.5％瓊脂糖封膠，設定電泳條件進行垂直聚焦，直至溴酚藍達膠底線停

5、止電泳。隨后對凝膠進行硝酸銀銀染。 3、凝膠圖像分析凝膠通過ImageScannerⅡ透射掃描儀及Labscan掃描軟件進行掃描獲取圖像，利用ImageMaster2DElite5.0分析軟件對圖像進行強度效正、點檢測、背景消減、匹配。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析在SPSS15.0軟件上進行。 4、MALDI—TOF—TOF—MS質(zhì)譜分析切取6個差異較明顯表達的蛋白質(zhì)點，通過膠內(nèi)酶切，點樣，應用基質(zhì)輔助電離解析飛行時間質(zhì)譜MALD

6、I—TOF/TOF—MS鑒定蛋白質(zhì)，獲得蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptidemassfingerprint，PMF)和二級質(zhì)譜圖。 5、數(shù)據(jù)庫檢索利用軟件Mascotdistiller過濾基線峰、識別信號峰。利用Matrixscience公司的Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫(http：//www.matrixscience.com)，尋找匹配的相關蛋白質(zhì)，同時查詢其功能，來明確鑒定的蛋白質(zhì)為何種蛋白質(zhì)。 6、酶

7、聯(lián)免疫吸附試驗另外30例腰椎間盤突出患者和30例正常人及非椎間盤突出患者共30例利用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定所得出蛋白的血清學水平。 結果： 1.建立了重復性好、分辨率高的LDH血清及正常人血清的雙向凝膠電泳圖譜，LDH組和正常對照組各3塊凝膠間的平均蛋白質(zhì)點數(shù)為(950±50)和(920±50)，其平均匹配百分率分別為85.8％和84.5％；同一樣本3塊不同膠之間在等電聚焦(Isoelectricfocusing，IEF)

8、方向的平均偏差為1.08±0.15mm，在十二烷基磺酸鈉聚丙稀酰胺凝膠電泳(Sodiumdodecylsulfate—polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS—PAGE)方向上的平均偏差為1.19±0.28mm。 2.比較分析10例LDH血清及正常人血清的雙向凝膠電泳圖譜進行分析匹配，其平均匹配的點數(shù)為960個。篩選出在LDH血清和正常人血清差異表達的蛋白質(zhì)共6個(表達量相差3倍以上的蛋白質(zhì)點作為

9、兩組差異表達蛋白質(zhì))，其中3個蛋白點在LDH組中表達下調(diào)，2個蛋白點表達上調(diào)，1個點在正常組組中不表達。 3.對6個差異表達的蛋白質(zhì)點進行MALDI—TOF/TOF—MS的鑒定，共獲得4張蛋白質(zhì)點的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，其中鑒定出一些與LDH發(fā)病機制可能相關的蛋白質(zhì)，分別為載脂蛋白L1(apolipoprotein—L1，ApoL1)、四連接素(Tetranectin，TN)、載脂蛋白M(apolipoproteinM，Ap

10、oM)和免疫球蛋白輕鏈(immunoglobulinlightchain，IGL)。 4.酶聯(lián)免疫吸附試驗對ApoL1、TN、ApoM和IGL的表達情況進行驗證。結果顯示與雙向電泳的分析結果是一致的，確實為陽性結果。 結論： 本研究采用比較蛋白質(zhì)組學的方法對LDH血清和正常人血清進行研究，建立了重復性好、分辨率高的LDH血清和正常人血清的雙向凝膠電泳圖譜，比較分析兩者蛋白質(zhì)表達譜的差異，識別并鑒定出其中的差異蛋白