第二章 基因工程中常用的工具酶

1、1第二章第二章基因工程中常用的工具酶基因工程中常用的工具酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸連接酶核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸聚合酶核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸酶核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸末端修飾酶核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類其它酶類用于生物細(xì)胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測等。21核酸內(nèi)切限制酶核酸內(nèi)切

2、限制酶定義：定義：核酸內(nèi)切限制酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。到目前為止已經(jīng)從許多種不同的微生物中分離出了2300種以上不同的核酸內(nèi)切限制酶。核酸內(nèi)切限制酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能（圖）核酸內(nèi)切限制酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能（圖）一、限制修飾系統(tǒng)的種類（圖）二、二、限制性內(nèi)切酶的定義、命名限制性內(nèi)切酶的定義、命名1.定義：定義：廣義指上述三個(gè)系統(tǒng)中的限制酶；狹義指II型限制酶。2.命名：命

3、名：限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、分離順序。例如：HindⅢ前三個(gè)字母來自于菌種名稱H.influenzae，“ｄ”表示菌系為ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分離到的第三個(gè)限制酶。EcI—EscherichiacoliRIHindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢSacI(II)—StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)三、三、Ⅰ型和型和Ⅲ型核酸內(nèi)切限制酶的缺點(diǎn)型核酸內(nèi)切限制酶的缺點(diǎn)a.Ⅰ型核酸內(nèi)切限制酶

4、雖然能夠識別DNA分子中的特定序列，但它們的切割作用卻是隨機(jī)的，在距特異性位點(diǎn)至少1000bp的地方可以隨機(jī)地切割DNA分子，因此這類酶在基因克隆中顯然是沒有用處的?！h(yuǎn)距離隨機(jī)切割b.Ⅲ型核酸內(nèi)切限制酶大約從距離識別序列25bp處切割DNA分子?！h(yuǎn)距離定點(diǎn)切割c.Ⅰ型核酸內(nèi)切限制酶和Ⅲ型核酸內(nèi)切限制酶，在切割反應(yīng)過程中，都會沿著DNA分子移動，因此是一種需要能量的過程?！枰芰康姆磻?yīng)d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸內(nèi)切限制酶，一般都是大型

5、的多亞基的復(fù)合物，既具有內(nèi)切酶活性，又具有甲基化酶活性?！獌?nèi)切酶活性和甲基化酶活性四、Ⅱ型核酸內(nèi)切限制酶的特點(diǎn)型核酸內(nèi)切限制酶的特點(diǎn)(1)基本特點(diǎn)：①在雙鏈DNA分子上有一個(gè)特殊的靶子序列，即所謂的識別序列，并由此切割DNA分子形成鏈的斷裂；——識別序列②2個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對的；——單鏈切割3a.限制酶識別位點(diǎn)周圍的堿基成分b.特定DNA分子中所具有的目標(biāo)限制酶識別位點(diǎn)的密度。c.完全消化超盤旋的

6、DNA要比完全消化等量的線性DNA需消耗更多的限制酶。d.DNA的甲基化程度完全切割不同來源的DNA樣品所需的限制酶單位（圖）(2)酶切消化反應(yīng)溫度a.最適酶切消化溫度不同的核酸內(nèi)切限制酶的最適的消化溫度是不同的。酶切溫度高于或低于最適溫度，都會影響限制酶活性，甚至失活。b.限制酶的星號活力限制酶的星號活力是指在酶反應(yīng)條件發(fā)生改變(變更)的情況下，該酶便失去了識別其固有的特異序列(識別位點(diǎn))的能力，而會在新的識別位點(diǎn)上發(fā)生DNA分子的切

7、割作用(即識別序列發(fā)生了改變)。(3)DNA純度酶切反應(yīng)體系中的一些試劑成分，會改變限制酶的切割特性。因此DNA制劑的純度對酶的活性會有很大的影響六、核酸內(nèi)切限制酶對六、核酸內(nèi)切限制酶對DNA的消化作用的消化作用應(yīng)用X射線晶體學(xué)技術(shù)，測定限制酶－DNA復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)的研究，指出Ⅱ型核酸內(nèi)切酶，是以同型二聚體形式與靶DNA序列發(fā)生作用，以EcⅠ為例，它是以同型二聚體上的6個(gè)氨基酸（每個(gè)亞基各有一個(gè)Glu和2個(gè)Arg殘基），同識別序列上的

8、嘌呤殘基形成12個(gè)氫鍵的形式，而結(jié)合到靶DNA識別序列并從此發(fā)生鏈的切割反應(yīng)。2.2DNA連接酶連接酶定義：能催化兩個(gè)DNA片段末端之間P和OH基團(tuán)形成磷酸二酯鍵，使兩個(gè)末端連接的酶稱為DNA連接酶（DNAligase）。目前已經(jīng)知道有四種方法可以在體外將DNA片段連接起來：a.用DNA連接酶將具有互補(bǔ)粘性末端的片段連接起來b.用T4DNA連接酶將平末端的DNA片段連接起來c.先在DNA片段兩端加上poly(dA)poly(dT)尾巴，