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1、基因組基因組DNASouthern雜交雜交1）基因組）基因組DNASouthern印跡的制備印跡的制備預備預備1用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化基因組DNA樣品（10μg）。2進行瓊脂糖凝膠電泳。一般用0.7～1.0％的瓊脂糖凝膠分離基因組DNA，它在1～15kb的范圍內(nèi)有較好的分辨率，可選用TBE或TAE緩沖液。瓊脂糖凝膠電泳需在1Vcm的電壓下進行，如果要分離片段大小相似的DNA帶，應(yīng)用較大的凝膠（2025cm）。常用的標準品是由HindⅢ

2、消化的λDNA、HaeⅢ消化的ΦX174DNA和100或1000bp的梯形圖譜。電泳完畢，將凝膠放在紫外透射儀上，并在凝膠旁放一尺子進行拍照。當把凝膠從盤內(nèi)移動紫外透射儀時，小心不要將凝膠滑落或弄破。Southern印跡的制備印跡的制備1將凝膠轉(zhuǎn)移至塑料盒內(nèi)。2加入至少4倍凝膠體積的0.25molLHCl使DNA脫嘌呤，置室溫搖床溫育15min。這時凝膠上樣緩沖液中的溴酚藍應(yīng)變黃色，如果15min后仍呈藍色，應(yīng)再溫育5min。3小心地塑

3、料盒內(nèi)HCl棄去，用蒸餾水漂洗凝膠一次。4加入至少4倍體積的變性緩沖液，置室溫搖床溫育20min。5用新鮮緩沖液重復步驟4，小心棄去變性緩沖液，用蒸餾水稍加漂洗。6加入至少4倍體積的中和反應(yīng)緩沖液，置室溫搖床溫育15min。7用新鮮緩沖液重復步驟6。8當處理凝膠時，裁一張略大于凝膠的濾膜（硝酸纖維膜或尼龍膜），預先用蒸餾水將濾膜浸濕后用20SSC浸泡至少15min。9安裝轉(zhuǎn)移裝置。在盤中加入印跡緩沖液（20SSC），在緩沖液面作一平臺，

4、比如可倒置一凝膠盤，上面蓋三張經(jīng)20SSC飽和過的濾紙（Whatman3MM），平臺兩側(cè)的濾紙應(yīng)浸泡在緩沖液中，用10ml的玻璃吸管在其表面小心滾動以趕出所有氣泡，并將濾5在95℃10min使探針變性，立即置冰浴冷卻5min。6剪去雜交袋的一角，將預雜交液倒入15或50ml的Falcon試管中，將約10～20ngml（隨機引物標記的）或50～100ngml（缺口平移法的）探針加到預雜交液或新鮮配制的雜交緩沖液中（如果打算用硫酸葡聚糖）。

5、一般來說，106～107cpmml已足夠，輕輕混勻，用一次性的塑料移液管將雜交液加到塑料袋內(nèi)的濾膜上。7從開角處將雜交液袋內(nèi)的氣泡全部擠出，用紙巾吸去流出的少許雜交液，小心封口以防雜交液漏出。必要的話，可將此雜交袋套在另一塑料袋中以防放射性污染。8在65℃水浴搖床中溫育或夾在兩塊玻璃板中置烤箱烘烤12～16h。9雜交后，剪去雜交袋的一角，擠出雜交混合液倒入15或50ml的Falcon管中，小心不要使放射性溶液濺出。10將雜交袋完全打開，

6、用鈍頭鑷子將濾膜轉(zhuǎn)移至盤內(nèi)以便漂洗，立即用緩沖液1（2SSC，0.1％SDS）洗濾膜。11室溫下，用漂洗緩沖液1漂洗濾膜三次，每次5min。12室溫下，用漂洗緩沖液2（0.25SSC，0.1％SDS）漂洗濾膜兩次，每次5min。13在65℃用預熱的漂洗緩沖液2洗膜1～3次，每次15min。在更換緩沖液之間，應(yīng)用蓋革計數(shù)器檢測滯留在印跡中心的放射性（將印跡中心所期望的特異性信號與印跡邊緣所期望的本底信號相比較）。14充分漂洗后，將濾膜放在