2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、動物細胞基因組動物細胞基因組DNA中小衛(wèi)星多態(tài)性的中小衛(wèi)星多態(tài)性的Southernblot檢測檢測實驗?zāi)康模赫莆蘸怂犭s交檢測技術(shù)(Southernblotting技術(shù))、核酸探針的標記技術(shù)、小衛(wèi)星DNA多態(tài)性檢測分析技術(shù)(DNA指紋圖譜技術(shù))和化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)。實驗原理:Southern印跡雜交技術(shù)包括兩個主要過程:一是將待檢測的核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移(電轉(zhuǎn)印、虹吸轉(zhuǎn)印、真空轉(zhuǎn)?。┎⒔Y(jié)合到一定的固相支持物(硝酸纖維素、尼龍膜)上,即

2、印跡(blotting);二是固定于膜上的核酸與特定標記[放射性同位素、地高辛(DIG)、生物素(biotin)等]的核酸探針在一定溫度和離子強度下復(fù)性(退火),即分子雜交。該技術(shù)是1975年英國愛丁堡大學(xué)Southern發(fā)明的,固命名Southern印跡雜交技術(shù)。利用Southern印跡雜交技術(shù)可進行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組中某一基因的定性和定量分析、基因突變分析及限制性長度片段多態(tài)性分析(RFLP)。固相膜核酸分子雜交的主要步

3、驟及原理如下:1、DNA的變性:DNA變性解鏈是雜交成功的關(guān)鍵。Southern印跡雜交時DNA在凝膠中變性,變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5MNaCl和0.5MNaOH中1h然后用數(shù)倍體積的1MTrisHCl(pH8.0)和1.5MNaCl溶液中和1h。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性,但強酸會使核酸降解。一般認為堿變性較好,可避免DNA降解。熱變性在要低DNA濃度(100μgml)和低鹽濃度(0.1MSSC含15mMNaCl

4、1.5mM檸檬酸三鈉,pH7.0)下進行。用SSC稀釋DNA溶液為50μgml,加10MNaOH使最終濃度為0.1M(pH約12.8),室溫變性10min,很快置冰鹽水中,用10MHCl或5MNaH2PO4調(diào)pH到7~8(亦可用堿變性后,調(diào)至中性,再加熱100℃10min),DNA變懷可用OD260增加(約30~40%)來檢測,變性DNA沉淀呈雪樣,完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12SSC,冰浴保存。2、變性DNA在硝酸纖維素膜

5、上的固定:硝酸纖維素濾膜(孔徑0.45μm)先在蒸餾水中充分浸泡,再用6SSC浸泡30min~2h,涼干。DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后,先室溫干燥4h,然后在80℃真空干燥2h。DNA樣品也可以轉(zhuǎn)移或加至尼龍膜(nylonmembrane)上,再用高溫烘烤或紫外交聯(lián)的處理固定在尼龍膜上。3、預(yù)雜交:濕潤的濾膜放入可加熱封口的塑料袋或雜交管中,按每平方厘米濾膜加0.2ml預(yù)熱至60℃的預(yù)雜交液(6SSC,0.5%SDS,5Denh

6、ardt液,100μgml鮭魚精DNA)。鮭魚精DNA需經(jīng)過剪切和DNA酶消化處理,然后酒精沉淀純化,調(diào)濃度至10mgml,用前放100℃水浴中煮沸變性10min,冰水驟冷。若在塑料袋中雜交,盡可能將袋中氣泡趕盡,可封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68℃水浴保溫3~12h。當(dāng)預(yù)雜交液溫度升至68℃時,在濾膜表面常會形成小氣泡。輕輕晃動袋中液體即可除去這些小氣泡,這一點對于保證濾膜表面充分浸潤預(yù)雜交液很重要。若在雜交管中雜交,只需將雜交管置

7、入核酸雜交爐(箱)內(nèi)的旋轉(zhuǎn)支架,調(diào)解到到一定轉(zhuǎn)速和雜交溫度,完成雜交。4、雜交:從水浴中取出塑料袋,用剪刀剪開一角,盡可能擠凈預(yù)雜交液。用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中,用恰好是足量的液體保持濾膜濕潤(50μlcm2)。溶液的組成是6SSC,0.01MEDTA變性的標記核酸探針,5Denhardt液,0.5%SDS100μgml變性的鮭魚精DNA。盡可能趕盡氣泡后,將塑料袋嚴密封口,雜交反應(yīng)在68℃水浴中進行,所需時間視探針和檢測靶DNA

8、的性質(zhì)及探針的比活性等情況而定,一般4~20h。若在雜交管中雜交,只需傾去預(yù)雜交液,雜交管內(nèi)加入含雜交探針的雜交液,繼續(xù)在核酸雜交爐完成雜交。圖252Southernblot技術(shù)逐步圖解實驗材料:[1].實驗24制備的基因組DNA。實際應(yīng)用中可采集人靜脈血EDTA抗凝,提取DNA。[2].限制性內(nèi)切酶HaeIII:FermentasLifeSciences[3].限制性內(nèi)切酶HinfI:FermentasLifeSciences[4].

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