雞Mx蛋白基因多態(tài)性檢測(cè)及其細(xì)胞定位的研究.pdf

1、Mx基因是Lindenmann在研究A2G小鼠抗流感病毒試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)的，因能抵抗粘液病毒而命名為Mx(myxovirus resistant)基因。關(guān)于禽類Mx蛋白的研究，1992年首次發(fā)現(xiàn)了鴨的Mx蛋白后，雞的Mx蛋白基因也被克隆，雞的Mx蛋白的抗病毒活性受2032位點(diǎn)單核苷酸引發(fā)631位氨基酸改變的影響，當(dāng)631位氨基酸為天冬酰胺時(shí)有抗病毒活性，為絲氨酸時(shí)則無(wú)抗病毒活性。本研究通過(guò)PCR-RFLP對(duì)我國(guó)不同品種雞Mx基因2032位點(diǎn)單

2、核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)；構(gòu)建EGFP-Mx融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞觀察Mx蛋白的細(xì)胞亞定位，同時(shí)進(jìn)行體外抗VSV病毒試驗(yàn)。旨在探索Mx蛋白的細(xì)胞分布情況及其抗病毒活性。主要研究結(jié)果如下： 1.研究采用錯(cuò)配PCR-RFLP的方法對(duì)15個(gè)品種雞的Mx基因進(jìn)行篩查，旨在探索不同雞品種Mx基因第2032位點(diǎn)抗病基因(A)與易感等位基因(G)的多態(tài)性，為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞的可行性提供理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果顯示，15個(gè)雞品種Mx基因的203

3、2位點(diǎn)存在2個(gè)等位基因(A、G)，3種基因型(AA、AG、GG)，其中鹿苑雞、狼山雞、斗雞未發(fā)現(xiàn)AA型個(gè)體，茶花雞、紅色原雞未發(fā)現(xiàn)GG個(gè)體；攜帶Mx抗性基因(A)和易感基因(G)的比例分別是0.350，0.650；抗性等位基因A的檢測(cè)比例為0.034～0.984。紅色原雞的抗性等位基因A基因頻率(0.984)顯著高于地方雞種的抗性等位基因A的基因頻率(0.321)；地方雞種中的觀賞型、蛋肉兼用型、肉用型、蛋用型雞種的抗性等位基因A的基因

4、頻率分別為0.221、0.297、0.425、0.462。X2適合性檢驗(yàn)表明15個(gè)品種的雞群均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。 2.設(shè)計(jì)引物去掉報(bào)告基因EGFP的終止密碼子，兩端加上酶切位點(diǎn)(EcoR V、Xba I)，用高保真酶擴(kuò)增出EGFP基因。將該P(yáng)CR產(chǎn)物與T載體連接，酶切測(cè)序鑒定正確后，雙酶切連接產(chǎn)物獲得EGFP基因，將其插入真核表達(dá)載體pcDNA3.0-MMx中，構(gòu)建重組表達(dá)載體EGFP-Mx，經(jīng)PCR、酶

5、切鑒定驗(yàn)證構(gòu)建正確后，提取并純化。采用電穿孔法轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h用熒光倒置顯微鏡觀察，同時(shí)RT-PCR鑒定其表達(dá)。結(jié)果顯示了構(gòu)建了EGFP-Mx融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到NIH-3T3細(xì)胞后48 h通過(guò)熒光倒置顯微鏡可以明顯看出綠色熒光分布于細(xì)胞質(zhì)中。 3.為了驗(yàn)證雞Mx蛋白的抗病毒能力，用VSV病毒株攻擊細(xì)胞的進(jìn)行抗病毒效應(yīng)試驗(yàn)。VSV抗性試驗(yàn)表明：在0.01TCID50 VSV對(duì)細(xì)胞感染48 h后，正常NIH-