DNA損傷修復基因多態(tài)性與肺癌的遺傳易感性及藥物基因組學研究.pdf

1、第一部分 DNA修復基因遺傳變異與肺癌易感性研究
　　第一節(jié) GTF2H1基因多態(tài)與肺癌遺傳易感性研究
　　肺癌已成為全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的癌癥,80-90％肺癌的發(fā)生與吸煙有著重要的聯(lián)系,但只有10-15％吸煙者會得肺癌,提示遺傳因素、遺傳多態(tài)性在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。DNA修復基因多態(tài)性作為個體損傷修復能力差異的分子遺傳學基礎(chǔ),可能是肺癌的遺傳易感因素。
　　GTF2H1(p62)蛋白在核苷酸切除修復(N

2、ER)通路中發(fā)揮重要作用,參與XPC-HR23B蛋白早期損傷識別,并招募核酸內(nèi)切酶XPG到損傷部位完成酶切過程。此外,GTF2H1蛋白參與轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)多個基因轉(zhuǎn)錄激活。
　　我們推測GTF2H1基因上的遺傳變異可能單獨或聯(lián)合影響中國人群肺癌的遺傳易感性。為了驗證這一假設(shè),我們在中國漢族人群的500例肺癌患者和517例年齡、性別與之相匹配的正常對照中,對GTF2H1基因上的6個單核苷酸多態(tài)(SNPs)位點進行了基因分型,探討了GTF2

3、H1基因的遺傳多態(tài)對肺癌患病風險的影響。同時,為研究-79 C＞T多態(tài)改變對GTF2H1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,我們構(gòu)建了分別含有C和T等位基因的GTF2H1啟動子區(qū)域的pGL3-Basic報告基因載體,進行了體外轉(zhuǎn)錄活性實驗。
　　我們發(fā)現(xiàn),在顯性模型下,3個SNP位點的突變基因型與野生型相比顯著增加肺癌風險效應,rs3802967(校正OR=1.38;95％CI=1.04-1.82),rs4150606(校正OR=1.44;95％

4、CI=1.08-1.92)和rs4150678(校正OR=1.37;95％CI=1.04-1.81)。Rs3802967 C/T+T/T基因型在男性人群中風險性更加顯著(P=0.002)。rs4150667顯示出與肺癌的負相關(guān),這一風險在隱性模型下更為顯著(校正OR=0.59,95％CI=0.38-0.93)。單倍型分析顯示單倍型“222212”(1代表常見等位基因,2代表罕見等位基因)顯著增加肺癌患病風險性(P=0.03)。熒光素酶報

5、告基因檢測實驗顯示攜帶T-等位基因報告基因載體有更高的熒光素酶表達活性,提示-79C→T改變可能影響GTF2H1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。因此,我們認為GTF2H1單核苷酸/單倍型多態(tài)可能與中國人群肺癌遺傳易感性有關(guān)。
　　第二節(jié) Rad52基因多態(tài)與肺癌遺傳易感性和藥物基因組學研究
　　煙草等外源物質(zhì)的暴露會造成雙鏈斷裂(DSBs)。同源重組(HR)修復是真核生物雙鏈斷裂損傷修復的主要方式,對于維持哺乳動物細胞的基因組完整性十分重要。

6、Rad52在同源重組早期結(jié)合到DSBs上,保護它免于外切核酸酶的攻擊,并協(xié)助由Rad51介導的同源重組的發(fā)生,在肺癌發(fā)生過程中扮演重要角色。
　　我們在中國漢族人群的500例肺癌患者和517例年齡、性別與之相匹配的正常對照中,對Rad52基因上的9個單核苷酸多態(tài)(SNPs)位點進行了基因分型,探討了Rad52基因的遺傳多態(tài)對肺癌患病風險的影響。同時,為研究3'UTR-104G＞A多態(tài)改變對Rad52基因的表達水平調(diào)控作用,我們構(gòu)建

7、了分別含有G和A等位基因的Rad523'UTR區(qū)域的pGL3-Promoter報告基因質(zhì)粒,進行了體外轉(zhuǎn)錄活性實驗。并通過生物信息學軟件預測和SPR實驗進一步探討了等位基因間表達差異的分子機理。
　　單位點分析發(fā)現(xiàn),Rad52基N3個位于調(diào)控區(qū)SNP rs10774474(P=0.002)。Rs11571378(P=1.647×10-5),rs1051669(P=0.002)在肺癌病例和對照組中的分布具有顯著差異,經(jīng)Bonferr

8、oni多重校正后,關(guān)聯(lián)均仍具有顯著性。全局顯著性檢驗表明rs10774474-rs11571378構(gòu)成的單倍型在病例組和對照組中的分布頻率存在顯著差異(P=0.007),10000次置換檢驗后,關(guān)聯(lián)仍顯著。單倍型‘12’(順序為rs10774474-rs11571378,1代表常見等位基因,2代表罕見等位基因)具有風險效應。對rs1051669(104G＞A)多態(tài)功能研究表明:rs1051669-A報告載體熒光素酶報告基因相對活性下降。

9、運用DINAMelt軟件預測發(fā)現(xiàn),G等位基因自由能更低,其可能通過形成更穩(wěn)定的局部二級結(jié)構(gòu)來穩(wěn)定mRNA增強報告基因的表達。同時,SPR實驗顯示,突變型A-等位基因RNA與胞質(zhì)抽提物調(diào)控因子結(jié)合能力更強。提示104G→A改變可能增強Rad52基因與負調(diào)控因子的結(jié)合而降低Rad52基因表達水平。以上結(jié)果提示Rad52基因單核苷酸多態(tài)可能與中國人群肺癌遺傳易感性有關(guān),在肺癌發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分非小細胞肺癌鉑類藥物化療

10、藥物基因組學研究
　　第一節(jié) XPD基因與非小細胞肺癌鉑類藥物化療關(guān)聯(lián)分析
　　非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌的80％,其中2/3的患者在確診時已處于晚期(Ⅲ或Ⅳ期),失去了手術(shù)機會。
　　鉑類藥物(順鉑、卡鉑)是目前治療晚期NSCLC的主要化學藥物。鉑進入細胞后,與DNA結(jié)合形成鉑-DNA加合物,導致DNA鏈間交聯(lián)或鏈內(nèi)交聯(lián),引起細胞死亡。DNA損傷修復能力的

11、差異可能是決定鉑類藥物療效的重要因素。XPD在機體核苷酸切除修復(NER)中扮演重要角色,擁有5’-3’DNA解旋酶活性,行使NER以及基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄過程中DNA結(jié)鏈作用。我們推測,XPD基因遺傳多態(tài)可能影響DNA損傷的修復移除能力,而導致個體間療效差異。鑒于此,我們觀察了445例接受鉑類為主化療的NSCLC患者治療后情況,采用MassARRAY時間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)檢測XPD基因三個潛在功能位點(p.Arg156Arg,p.Asp312A

12、sn,p.Asp711Asp)遺傳多態(tài),以探討該基因單核苷酸多態(tài)與NSCLC患者對鉑類藥物化療療效,毒副反應及預后的關(guān)系。
　　非條件logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),XPD基因p.Arg156Arg位點純合突變A/A基因型顯著增加患者發(fā)生3-4度血液毒性風險性,進一步分析發(fā)現(xiàn),該遺傳多態(tài)與3-4度白細胞毒性顯著相關(guān)(趨勢檢驗P=0.007),經(jīng)Bonferroni多重校正后,關(guān)聯(lián)均具有顯著性。單倍型/二倍型分析顯示,單倍型‘CG’的

13、攜帶者發(fā)生白細胞毒性的風險顯著降低,經(jīng)過10,000次置換檢驗后,關(guān)聯(lián)均具有顯著性。在諾維本聯(lián)合順鉑用藥人群中,XPD p.Arg156Arg突變基因型A/A顯著增加鉑類藥物敏感性(P=0.003),血液毒性風險性(P=0.012),白細胞毒性風險性(P=0.003)。XPD p.Asp312Asn,p.Asp711Asp多態(tài)與肺癌患者總生存期顯著相關(guān)(10g-rankP分別為0.006,0.006)。XPDp.Asp312Asn多態(tài)在

14、ⅢB期人群中與預后關(guān)聯(lián)更加顯著(10g-rank P=7.25×10-5)。
　　本研究首次發(fā)現(xiàn),XPD基因遺傳多態(tài)與晚期肺癌患者鉑類藥物化療后的血液毒性,總生存期顯著相關(guān)。XPD p.Arg156Arg,p.Asp312Asn,p.Asp711Asp單核苷酸多態(tài)性有可能作為檢測指標來預測鉑類藥物的不良反應和預后風險,成為指導該類藥物的個體化用藥的依據(jù)。
　　第二節(jié)中國人群晚期非小細胞肺癌鉑類為主化療藥物基因組學研究

15、　　鉑類耐藥由多種因素引起,包括藥物解毒增加;DNA損傷修復能力增強;細胞耐受性增加等。核苷酸切除修復(NER)主要修復各種大片段DNA損傷造成的DNA雙螺旋扭曲,如鏈內(nèi)交聯(lián),同源重組(HR)修復鏈間交聯(lián)(ICL),錯配修復(MMR)對藥物所致的加合物的識別及處理產(chǎn)生一種前凋亡信號。此外,葉酸代謝,炎癥因子等因素均與鉑類耐藥相關(guān)。
　　本部分研究收集445例以鉑類藥物為主化療NSCLC患者血樣及其臨床資料,采用候選通路策略,選擇了

16、以上通路XPC,XPF,XPG,MLH1,MSH2,MTHFR,XRCC3,lig4,Rad52,IL-1a,IL-1b等11個關(guān)鍵基因的17個SNP位點,通過基因多態(tài)與化療近期療效、不良反應及遠期生存期的關(guān)聯(lián)分析,尋找與NSCLC患者對鉑類藥物敏感性相關(guān)的基因及其多態(tài)位點。
　　單位點分析表明,MTHFR rs1801131與化療敏感性相關(guān)。接受諾維本聯(lián)合鉑類用藥亞組人群分層分析發(fā)現(xiàn)Rad52 rs1051669 A/A基因型增

17、加化療療效敏感性。7個基因上的9個SNP多態(tài)與不良反應顯著相關(guān)。False discovery rate多重校正后,IL-1b rs16944(-511 C＞T),rs1143627(-31T＞C)與3-4度白細胞毒性和3-4度粒細胞毒性關(guān)聯(lián)仍具有顯著性。分層分析顯示,rs16944與3-4度白細胞毒性相關(guān)性在非吸煙人群中更顯著(校正OR=5.10,95％CI=2.31-11.19,P=5.41×10-5);其與3-4度粒細胞減少相關(guān)性

18、在非吸煙者(校正OR=16.38,95％CI=5.88-45.61,P=8.84×10-8),女性(校正OR=12.87,95％CI=3.70-44.76,P=5.92×10-5)亞組人群中更顯著。進一步基因.環(huán)境交互分析表明,IL-1 b rs16944基因型,rs1143627基因型與吸煙狀態(tài)、性別因素在對白細胞減少、粒細胞減少發(fā)生的影響中呈現(xiàn)顯著的交互作用。在粒細胞減少不良反應中,rs16944基因型-吸煙,rs16944基因型-

19、性別交互作用P值分別為0.001,0.007。
　　攜帶XPC rs222800 T/T基因型個體生存期低于攜帶C/C+C/T基因型個體(MST,14個月v18個月),攜帶Rad52 rs1051669 A/A基因型個體生存期低于攜帶野生型G/G+A/G個體(MST,7個月v18個月),差別具有統(tǒng)計學意義。
　　本研究首次從整體上探索了DNA損傷修復通路,葉酸代謝通路及炎癥通路基因多態(tài)和肺癌化療療效,不良反應及總生存期的關(guān)系