有機溶劑蛋白質沉淀

1、蛋白質純化方法蛋白質濃縮有多種方法，有鹽析，超濾，離子交換，有機溶劑沉淀等方法。有機溶劑沉淀法：有機溶劑能降低溶液的電解常數(shù)，從而增加蛋白質分子上不同電荷的引力，導致溶解度的降低；另外，有機溶劑與水的作用，能破壞蛋白質的水化膜，故蛋白質在一定濃度的有機溶劑中的溶解度差異而分離的方法，稱“有機溶劑分段沉淀法”，它常用于蛋白質或酶的提純。使用的有機溶劑多為乙醇和丙酮。高濃度有機溶劑易引起蛋白質變性失活，操作必須在低溫下進行，并在加入有機溶劑

2、時注意攪拌均勻以避免局部濃度過大。由此法析出的沉淀一般比鹽析容易過濾或離心沉降，分離后的蛋白質沉淀，應立即用水或緩沖液溶解，以降低有機溶劑濃度。操作時的pH值大多數(shù)控制在待沉淀蛋白質的等電點附近，有機溶劑在中性鹽存在時能增加蛋白質的溶解度，減少變性，提高分離的效果，在有機溶劑中添加中性鹽的濃度為0.05molL左右，中性鹽過多不僅耗費有機溶劑，可能導致沉淀不好。沉淀的條件一經(jīng)確定，就必須嚴格控制，才能得到可重復的結果。醫(yī)學教育`網(wǎng)搜集整

3、理有機溶劑濃度通常以有機溶劑和水容積比或用百分濃度表示。有機溶劑沉淀蛋白質分辨力比鹽析法好，溶劑易除去；缺點是易使酶和具有活性的蛋白質變性。故操作時要求條件比鹽析嚴格。對于某些敏感的酶和蛋白質，使用有機溶劑沉淀尤其要小心。可與水混合的有機溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對水的親和力很大，能破壞蛋白質顆粒的水化膜，在等電點時使蛋白質沉淀。在常溫下，有機溶劑沉淀蛋白質往往引起變性。例如酒精消毒滅菌就是如此，但若在低溫條件下，則變性進行較緩慢，可

4、用于分離制備各種血漿蛋白質。微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實驗目的來確定。對于微生物，應注意它的生長期，在微生物的對數(shù)生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時有兩種情況：（1）得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等；（2）利用菌體含有的生化物質，如蛋白質、核酸和胞內酶等。植物材料必須經(jīng)過去殼，脫脂并注意植物品種和生長發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)

5、性關系密切。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進行絞碎、脫脂等處理。另外，對預處理好的材料，若不立即進行實驗，應冷凍保存，對于易分解的生物大分子應選用新鮮材料制備。蛋白質的分離純化一，蛋白質（包括酶）的提取大部分蛋白質都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類結合的蛋白質則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質及酶。（一）水溶液提取法稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質穩(wěn)定性好、溶解

6、度大、是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的15倍，提取時需要均勻的攪拌，以利于蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面，多數(shù)蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基于這一點考慮提取蛋白質和酶時一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面著重討論提取液的pH值和

7、鹽濃度的選擇。1、pH值蛋白質，酶是具有等電點的兩性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH范圍內。用稀酸或稀堿提取時，應防止過酸或過堿而引起蛋白質可解離基團發(fā)生變化，從而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏堿性的提取液。2、鹽濃度稀濃度可促進蛋白質的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優(yōu)點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一

8、般以0.15摩爾升濃度為宜。緩沖液常采用0.020.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。（二）有機溶劑提取法一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優(yōu)越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶