第一節(jié) 間接法測抗體

1、第一節(jié)間接法測抗體1.基本原理將特異性抗原包被在固相載體上，形成固相抗原，加入待檢標(biāo)本（含相應(yīng)抗體），其中抗體與固相抗原形成抗原抗體復(fù)合物，再加入酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體，亦稱二抗），與上述抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。此時加入底物，復(fù)合物上的酶則催化底物而顯色。2.試劑與設(shè)備z純化抗原。z酶標(biāo)抗體（辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人免疫球蛋白）z底物(鄰苯二胺OPD或四甲聯(lián)苯胺TMB)z底物緩沖液（Na2HPO40.184g構(gòu)椽酸0.047gH2

2、O10mlH2O25ul）zPBS（見附錄）zpH9.6碳酸鹽緩沖液CBS（見附錄）z洗液（PBS0.05%體積的Tween20）z稀釋液（100mlPBS1g牛血清血蛋白）z終止液（２molLH2SO4）z酶標(biāo)板（聚苯乙烯板）z微量加樣器z吸水紙z封口膠帶z酶標(biāo)儀z洗板機(jī)等。3.實(shí)驗(yàn)步驟一予試驗(yàn)（一）抗原包被的酶標(biāo)板的制備１.以碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋成適當(dāng)濃度（參考：5ugml），加入酶標(biāo)板（50ul孔），以膠帶封口，于4℃過夜。２.

3、棄抗原液，以雙蒸水沖洗3次，自然干燥后以膠帶封口。此為已知抗原包被的酶標(biāo)板，備用。（二）底物濃度的摸索在底物緩沖液中加入不同量的底物（參考：5mg10ml），加入酶標(biāo)板中（50ul孔），以膠帶封口，37℃避光保存2h，在沒有明顯變色的條件下選擇盡可能大的底物濃度。（三）酶標(biāo)抗體濃度的摸索1用稀釋液稀釋酶標(biāo)抗體至適當(dāng)倍數(shù)（參考：40~4000倍），加入已包被抗原的酶標(biāo)板中（50ul孔），封口后于37℃作用30min。以洗液連續(xù)沖洗5次，然

4、后于吸水紙上拍干，加入已摸索好的底物封口后于37℃作用2h，在沒有變色的條件下選擇盡可能大的酶標(biāo)抗體濃度。（四）待測標(biāo)本濃度的摸索選擇明確為陰性的標(biāo)本，以稀釋液做適當(dāng)稀釋（至少5倍以上，參考：100倍），封口后于37℃作用1h，按上述條件洗板（連續(xù)沖洗5次），加入已確定濃度的酶標(biāo)抗體，再洗板，再加入已確定的底物，選擇無明顯發(fā)色的最大濃度的標(biāo)本。二正式試驗(yàn)形成的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，當(dāng)加入與酶相應(yīng)的底物時，酶催化底而顯色，根據(jù)顏色的有無和顏

5、色的深淺對待測抗原進(jìn)行定性和定量。2.試劑與設(shè)備z純化抗待測抗原的抗體（包被用）。z酶標(biāo)抗體（辣根過氧化物酶標(biāo)記抗待測抗原的抗體）z底物(鄰苯二胺OPD或四甲聯(lián)苯胺TMB)z底物緩沖液（Na2HPO40.184g構(gòu)椽酸0.047gH2O10mlH2O25ul）zPBS（見附錄）zpH9.6碳酸鹽緩沖液CBS（見附錄）z洗液（PBS0.05%體積的Tween20）z稀釋液（100mlPBS1g牛血清血蛋白）z終止液（２molLH2SO4）

6、z酶標(biāo)板（聚苯乙烯板）z微量加樣器z吸水紙z封口膠帶z酸標(biāo)儀z洗板機(jī)等3.實(shí)驗(yàn)步驟一予試驗(yàn)3（一）抗體包被的酶標(biāo)板的制備１.以碳酸鹽緩沖液將抗體稀釋成適當(dāng)濃度（參考：5ugml），加入酶標(biāo)板（50ul孔），以膠帶封口，于4℃過液。２.棄抗體液，以雙蒸水沖洗3次，自然干燥后以膠帶封口。此為由已知抗體包被的酶標(biāo)板，備用。（二）底物濃度的摸索在底物緩沖液中加入不同量的底物（參考：5mg10ml），加入酶標(biāo)板中（50ul孔），以膠帶封口，37℃

7、避光保存2h，在沒有明顯變色的條件下選擇盡可能大的底物濃度。（三）酶標(biāo)抗體濃度的摸索用稀釋液稀釋酶標(biāo)抗體至適當(dāng)倍數(shù)（參考：40~4000倍），加至已包被抗體的酶標(biāo)板中（50ul孔），封口后于37℃作用30min。以洗液連續(xù)沖洗5次，然后于吸水紙上拍干，加入已摸索好的底物封口后于37℃作用2h，在沒有變色的條件下選擇盡可能大的酶標(biāo)抗體濃度。（四）待測樣本濃度的摸索選擇明確為陰性的標(biāo)本，以稀釋液做適當(dāng)稀釋（至少5倍以上，參考：100倍），封