實驗動物胚胎工程技術(shù)

1、第一節(jié) 概述,工程:通過構(gòu)想、設(shè)計，按照人們的意愿制作、改造某一事物，以達(dá)到預(yù)想的目的。生物工程： 按照工程學(xué)原理，對生物體或生物大分子進(jìn)行改造或利用，用于生產(chǎn)、研究、檢定和創(chuàng)造新物種的綜合性科學(xué)技術(shù)。 遺傳（基因）工程 蛋白質(zhì)工程 酶工程 細(xì)胞工程 微生物工程 胚胎工程 組織工程,,,分子水平,細(xì)胞水平,組織水平,,2024/3/24,

2、1,胚胎工程（Embryonic engineering）又稱胚胎技術(shù),是指用工程學(xué)的原理對動物的胚胎進(jìn)行某種技術(shù)操作或改造，使之獲得人們所需要動物的一系列生物技術(shù)的總稱。一、胚胎操作基本技術(shù) 1.超數(shù)排卵和卵母細(xì)胞、精子、受精卵的采集 2.體外受精 3.胚胎性別控制 4.胚胎分割 5.胚胎培養(yǎng) 6.胚胎移植 7.胚胎冷凍保存二、體細(xì)胞克隆技術(shù) 三、干細(xì)胞技術(shù)四、外源基因?qū)爰夹g(shù),20

3、24/3/24,2,胚胎工程的應(yīng)用,1.畜牧業(yè)：通過建立超數(shù)排卵、受精卵/卵母細(xì)胞的采集、體外受精、胚胎切割、胚胎性別控制、體細(xì)胞克隆以及胚胎移植技術(shù)，加快良種家畜的繁殖和家畜品種的改良。,2024/3/24,3,2.生物制藥：通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將具有藥用價值的生物活性蛋白的基因整合到宿主的染色體上，使其在乳汁、血液、尿液等體液中表達(dá)。通過收集、純化這些體液中的生物活性蛋白，用于預(yù)防和治療某些人類的疾病。,2024/3/24,4,已在乳腺表

4、達(dá)的生物活性蛋白并進(jìn)入臨床2期或3期試驗：抗凝血酶一Ⅲ抗胰蛋白酶蛋白C乳鐵蛋白乳糖酶,3.醫(yī)學(xué)：通過建立卵母細(xì)胞的采集、體外受精、顯微受精以及胚胎移植技術(shù)，用于不孕癥的治療；通過對胚胎培養(yǎng)和檢測，剔除具有遺傳性疾病的胚胎，達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的。4.生命科學(xué)研究：闡明哺乳動物早期胚胎發(fā)生、發(fā)育機制等基礎(chǔ)理論。5.拯救瀕危野生動物：通過野生動物生殖細(xì)胞和組織的冷凍保存、體細(xì)胞克隆和胚胎移植技術(shù)，擴(kuò)大野生動物的種群。,2024/3

5、/24,5,第二節(jié) 胚胎操作基本技術(shù),2024/3/24,6,2024/3/24,7,胚胎操作的整個過程局限在胚胎的早期發(fā)育,,一、精子、卵母細(xì)胞、受精卵的采集和超數(shù)排卵,1.精子的采集 嚙齒類小動物精子的采集大都從體成熟雄性動物的附睪獲取。將動物處死后，分離附睪尾部，用眼科剪子在頂端剪一小口，用手指輕柔擠出濃稠的液滴，置培養(yǎng)液中培養(yǎng)。大動物的精子采集可采用假陰道或電刺激法促進(jìn)雄性射精，收集精液。,2024/3/24,8,2.卵

6、母細(xì)胞和受精卵的采集 從體內(nèi)成熟并排到輸卵管中去，需通過處死動物或外科手術(shù)獲取卵母細(xì)胞；如果在交配后，則可獲取受精卵或早期胚胎。取自屠宰淘汰的或剛死亡的雌性動物的卵巢，從卵巢中分離卵母細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)而得。,2024/3/24,9,3.超數(shù)排卵（Superovolation）技術(shù)：通過注射激素刺激卵巢大量排卵。經(jīng)超數(shù)排卵處理，動物卵巢大量的卵泡同時成熟并排出，排卵數(shù)可增加幾倍至十幾倍，一次可獲得大量的卵細(xì)胞、受精卵或早期胚胎。所用激素

7、有促卵泡激素（FSH）、人絨毛膜促性腺激素(HCG)和孕馬血清促性腺激素（PMSG）、孕酮和前列腺素（PG）等，以前三種常用。,2024/3/24,10,2024/3/24,11,二、體外受精,體外受精（In vitro fertilization）是指成熟精子與卵母細(xì)胞在體外環(huán)境下完成受精的過程。這一過程包括卵母細(xì)胞的收集或未成熟卵母細(xì)胞的培養(yǎng)成熟、精子的獲取、獲能處理、受精及受精后胚胎培養(yǎng)等。 體外受精（IVF）聯(lián)合胚胎移植技術(shù)又

8、稱試管嬰兒技術(shù)。,2024/3/24,12,三、胚胎性別控制,性別控制的研究，是畜牧業(yè)生物技術(shù)中一項重要的高新技術(shù)。這項技術(shù)的應(yīng)用，可以使畜牧上大動物的繁殖按照人們的意愿只生產(chǎn)同一性別動物。在醫(yī)學(xué)上，性別控制的研究也具有積極的意義。有的遺傳性疾病屬于性連鎖遺傳，例如進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良，為X連鎖隱性遺傳，男性發(fā)病，女性攜帶異常基因但不發(fā)病。攜帶此致病基因的女性懷孕后如做胚胎性別鑒定，則可避免男性患兒的出生。,2024/3/24,13,性別

9、控制技術(shù)通過對X精子與Y精子分離以控制性別。在胚胎移植前對胚胎的性別進(jìn)行鑒定以控制性別。通過控制飼料特性、受精環(huán)境如改變精液或陰道的PH值等來控制性別。,2024/3/24,14,（一）分離X精子與Y精子以控制性別 分離X精子與Y精子的依據(jù)：X、Y精子在體積、密度、電荷、運動性和DNA含量、表面抗原等方面存在差異。將X和Y精子分離再通過人工授精可以有效地達(dá)到性別控制的目的。 目前將X和Y精子分離的方法有沉降法、電泳法、免疫法和

10、流式細(xì)胞儀法等。流式細(xì)胞儀法是當(dāng)前分離X、Y精子較準(zhǔn)確的方法，具有重復(fù)性、科學(xué)性和有效性的特點。,2024/3/24,15,應(yīng)用流式細(xì)胞儀分離X和Y精子的原理：X精子的DNA含量比Y精子的高。對于奶牛，X精子比Y精子DNA含量高3.8％，由于染料著色量與精子DNA含量成正比，因此X精子吸收的染料多，發(fā)出的熒光就比Y精子強。,2024/3/24,16,具體的做法：先用DNA特異性染料對精子進(jìn)行活體染色，然后精子連同少量稀釋液逐個通過激

11、光束。探測器根據(jù)精子的發(fā)光強度把電信號傳遞給計算機，計算機指令液滴充電使發(fā)光強度高的液滴帶正電，弱的帶負(fù)電。即X精子帶上正電荷，Y精子帶上負(fù)電荷。當(dāng)經(jīng)過高壓電場時會向不同方向偏轉(zhuǎn)，達(dá)到分離的目的。,2024/3/24,17,（二）對胚胎進(jìn)行鑒定以控制性別 在胚胎移植前對胚胎的部分組織用染色體檢查、間接免疫熒光法和PCR法進(jìn)行性別鑒定。其中PCR法因有可靠的操作程序，具有高效、快速的特點，近年來得到迅速的發(fā)展。 Y染色體短臂上有決定雄

12、性的DNA片段-SRY基因(sex-determining region of Y-chromosome,全稱:Y染色體性別決定區(qū))，為胚胎性別鑒定提供了可靠的途徑。,2024/3/24,18,2024/3/24,19,四、胚胎培養(yǎng),胚胎培養(yǎng)是指將獲得的早期胚胎在體外人工環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，以觀察其發(fā)育或人工干預(yù)某一發(fā)育過程的可能性。,2024/3/24,20,胚胎培養(yǎng)一般應(yīng)用于以下幾個方面：1.未成熟卵母細(xì)胞通過體外培養(yǎng)，成熟后進(jìn)行體外

13、受精。2.受精卵通過體外培養(yǎng)發(fā)育成各階段的早期胚胎，用于胚胎移植或胚胎冷凍保存。3.冷凍保存胚胎解凍后，通過體外培養(yǎng)，篩選成活胚胎用于胚胎移植。4.通過研究胚胎發(fā)育的環(huán)境和條件，不斷完善胚胎培養(yǎng)條件，揭示胚胎細(xì)胞的生長發(fā)育和分化的奧秘。 目前胚胎培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)可以將未成熟卵在體外成熟，并通過體外受精發(fā)育成各階段的早期胚胎。即使如此，在體外胚胎培養(yǎng)也只能發(fā)育到囊胚期，需要在囊胚期前移植到動物的子宮內(nèi)。,2024/3/24,21,五、

14、胚胎移植,---胚胎工程的最后一道工序 將受精卵或發(fā)育到一定時期的早期胚胎,移植到受體動物生殖管道的一定部位,能在子宮內(nèi)著床、生長、發(fā)育、分娩、出生仔代動物的技術(shù)稱為胚胎移植。幾乎所有的胚胎工程技術(shù)在體外完成對胚胎的操作后，都需經(jīng)過胚胎移植這一步驟，得到我們所要的動物。,2024/3/24,22,體外培養(yǎng)的胚胎必須移植到同步發(fā)情的雌性動物生殖管道內(nèi)。1.利用自然同期發(fā)情的母畜，此法在實踐上較難辦到。 2.通過注射某些激素(如孕激

15、素、雌激素等)誘發(fā)同期發(fā)情。 不同發(fā)育階段的胚胎移植的部位不同。 受精卵和2細(xì)胞胚胎應(yīng)移植到輸卵管內(nèi)，而桑椹胚和囊胚期胚胎應(yīng)移植到子宮內(nèi)，以跟正常妊娠生殖生理變化同步。,2024/3/24,23,同一種屬內(nèi)的不同品種品系可互相進(jìn)行胚胎移植。如近交系C57BL/6J小鼠的胚胎可移植到雌性封閉群ICR的生殖管道內(nèi)；日本大耳白兔的胚胎可移植到雌性新西蘭兔的生殖管道內(nèi)。這一特點在畜牧業(yè)特別有用，如為了加快良種奶牛的繁殖，可將良種奶牛的胚胎

16、移植到普通黃牛的生殖管道內(nèi)，借腹懷胎。,2024/3/24,24,六、胚胎冷凍保存,胚胎冷凍保存（embryo cryopreservation）技術(shù)是指在低溫（-196℃液氮內(nèi)）條件下利用低溫保護(hù)劑保存生殖細(xì)胞及胚胎的一門技術(shù)。,2024/3/24,25,（一）胚胎冷凍保存的機制 低溫降低了胚胎內(nèi)的生化反應(yīng)速度。并且溫度越低，保存時間就越長。 低溫?fù)p傷：如果冷卻速度過慢，胞外溶液中水分大量結(jié)冰，溶液濃度提高，胞內(nèi)水分大量滲出，導(dǎo)致

17、細(xì)胞的強烈收縮和細(xì)胞處于高濃度的溶液中時間過長，從而造成化學(xué)損傷；如果冷卻速度過快，胞內(nèi)水分來不及通過細(xì)胞膜向外滲出，胞內(nèi)溶液過冷而結(jié)冰，從而造成物理損傷。在復(fù)溫（解凍）過程中，如果復(fù)溫速率不當(dāng)也可能引起細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰（重結(jié)冰）而損傷。,2024/3/24,26,采用低溫保護(hù)劑防止低溫?fù)p傷： 二甲基亞砜（DMSO）、聚乙烯砒咯烷酮(pvp)、甲醇、乙二醇、羥甲基淀粉（HES）等可以避免或減少結(jié)冰的程度與速度，降低細(xì)胞周圍未凍結(jié)

18、溶液中的電解質(zhì)濃度，從而避免或減少胚胎冷凍過程中所發(fā)生的物理和化學(xué)損傷。,2024/3/24,27,（二）胚胎冷凍保存技術(shù)的應(yīng)用 1. 應(yīng)用于實驗動物的育種和保種。 ⒉ 應(yīng)用于實驗動物胚胎的長途運輸。 ⒊ 應(yīng)用于實驗動物的生物凈化。 ⒋ 應(yīng)用于珍稀或瀕危動物種質(zhì)保存。,2024/3/24,28,第三節(jié) 動物體細(xì)胞克隆技術(shù),2024/3/24,29,克隆（clone）的概念 克隆是指無性繁殖或拷貝。 無

19、性生殖在植物中很常見，在動物中過去認(rèn)為是不可能的。 動物克隆是指動物通過體細(xì)胞核移植后生產(chǎn)出基因型幾乎與供體完全相同的后代。,2024/3/24,30,核移植（Nuclear transfer）是指將動物細(xì)胞的細(xì)胞核移植到另一個體的去核卵母細(xì)胞胞質(zhì)中，通過電激活，使供體核重編程序，形成的重構(gòu)卵在體外培養(yǎng)成胚胎，最后通過胚胎移植，使之發(fā)育成個體。 如果受體去核卵和供體移入的核來自同種動物，則稱種內(nèi)核移植，來自不同的種則稱為種

20、間核移植。核移植由于沒有經(jīng)過精子和卵子的受精過程，核移植動物的全部遺傳信息來自供體核細(xì)胞，等于是復(fù)制了提供細(xì)胞核的動物，因而把它俗稱為“克隆”。,2024/3/24,31,根據(jù)供體核的來源不同，核移植包括以下幾種： 胚胎細(xì)胞核移植：未著床前的囊胚（未分化）胚胎干細(xì)胞核移植（未分化）胎兒成纖維細(xì)胞：出生前的胎兒（未分化或低分化）成年體細(xì)胞（已分化）,2024/3/24,32,2024/3/24,33,,動物克隆的實驗過程,動物克

21、隆技術(shù)的意義與應(yīng)用,加快良種家畜的繁殖速度與體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合，能制備大家畜轉(zhuǎn)基因動物拯救瀕危野生動物治療性克隆，用于再生醫(yī)學(xué),2024/3/24,34,再生醫(yī)學(xué)技術(shù)路線簡介,2024/3/24,35,第四節(jié) 干細(xì)胞技術(shù),2024/3/24,36,一、概述干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞。根據(jù)發(fā)育階段，可將干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ES細(xì)胞)和成體干細(xì)胞(adult

22、 stem cells，AS細(xì)胞)。ES細(xì)胞存在于囊胚期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中，是全能性、無限增殖的干細(xì)胞，在胚胎的生長發(fā)育過程中具有分化形成胎兒所有類型細(xì)胞、組織和器官的潛能。AS細(xì)胞是ES細(xì)胞定植于胎兒和成人的各種組織和器官中的“種子”，具有自我更新和分化為組織特異細(xì)胞的能力，即分化為相應(yīng)組織和器官中細(xì)胞的“專能”細(xì)胞，包括神經(jīng)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、精原干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞和肝臟干細(xì)胞等。,2024/3/24,3

23、7,2024/3/24,38,誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells,iPS 細(xì)胞) 2006年,Takahashi等首次發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子基因能夠使已分化的細(xì)胞重編程回歸到胚胎細(xì)胞狀態(tài)。他們通過慢病毒載體介導(dǎo)將Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4 4 種轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)胄∈笃つw成纖維細(xì)胞, 獲得了具有強大的自我更新能力和分化潛能的多能性干細(xì)胞, 命名為iPS 細(xì)胞。這一研究克服了

24、ES細(xì)胞和AS細(xì)胞應(yīng)用存在的諸多問題，展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景，受到了整個生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。目前研究中較為理想的供體細(xì)胞主要有淋巴細(xì)胞(如T細(xì)胞和B細(xì)胞等)、脂肪細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞。,2024/3/24,39,二、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞)來源：ES細(xì)胞是從胚胎發(fā)育早期囊胚（人胚胎受精后約5-7天，小鼠胚胎受精后3-4天）中的內(nèi)細(xì)胞群分離出來的未分化細(xì)胞。內(nèi)細(xì)胞群:具有未分化特性，可進(jìn)一步分裂,分化形成內(nèi)、中、外三個胚層。 外胚

25、層將分化為皮膚、眼睛和神經(jīng)系統(tǒng)等 中胚層將形成骨骼、血液和肌肉等組織 內(nèi)胚層將分化為肝、肺和腸等由于內(nèi)細(xì)胞群可以發(fā)育成完整的個體，因而這些細(xì)胞被認(rèn)為具有全能性。當(dāng)內(nèi)細(xì)胞群分離出來后在體外培養(yǎng)時，我們稱之為ES細(xì)胞。,2024/3/24,40,2024/3/24,41,目前除了從小鼠、大鼠和人分離得到并建立ES細(xì)胞系外，還未從其它動物的囊胚中分離到ES細(xì)胞系。,（二）ES細(xì)胞的培養(yǎng) ES細(xì)胞的培養(yǎng)條件極其苛刻，對培養(yǎng)液、試劑、

26、胎牛血清、水等均需采用胚胎級，對培養(yǎng)器皿等必須清洗干凈。一旦條件不適合，ES細(xì)胞容易發(fā)生分化，從而失去ES細(xì)胞的特性。 未分化ES細(xì)胞的培養(yǎng)一般需要與用絲裂霉素處理過的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層（Feeder cell）共培養(yǎng)，飼養(yǎng)層細(xì)胞為ES細(xì)胞提供細(xì)胞因子來維持其未分化狀態(tài)。在培養(yǎng)液中加用白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor，LIF）能更有效地維持未分化的ES細(xì)胞。,2024/3/24,42,（三）ES細(xì)胞的

27、鑒定 ES細(xì)胞是一種正常的胚胎性干細(xì)胞，具有正常的染色體核型和體內(nèi)外分化的潛能。在建系之初需要對其核型、分化能力和細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行鑒定 1．核型 2．體外分化試驗 將ES細(xì)胞在無飼養(yǎng)層、低胎牛血清的培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，數(shù)天后形成胚樣小體（embryoid bodies）的內(nèi)皮樣大型細(xì)胞團(tuán)；向成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及造血細(xì)胞的分化。 3．體內(nèi)分化試驗 將ES細(xì)胞懸液注射到同性別小鼠的腹股溝皮下，2周后注射部位出現(xiàn)腫塊，病理檢

28、查為畸胎瘤?；チ鰞?nèi)部有多種細(xì)胞生長，如上皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及干細(xì)胞集落等，也可看到各胚層組織的分化，如軟骨、肌肉組織、上皮組織及腺體等。 4．ES細(xì)胞的標(biāo)志物 Oct-4: Oct-4（也叫Oct-3或Oct3/4）屬POU轉(zhuǎn)錄因子一員，它在全能胚胎干細(xì)胞(ES)和生殖細(xì)胞表達(dá)。該表達(dá)對于維持干細(xì)胞的自我更新和多能性是必要的。ES的分化導(dǎo)致Oct-4的下調(diào)。 SSEAs: 人ES細(xì)胞表達(dá)SS

29、EA-3和SSEA-4，但不表達(dá)SSEA-1。小鼠ES細(xì)胞表達(dá)SSEA-1，但不表達(dá)SSEA-3或SSEA-4。,2024/3/24,43,（四）胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用1.用于研究哺乳動物個體的發(fā)生發(fā)育規(guī)律　　由于ES細(xì)胞可分化為胚胎內(nèi)胚層、中胚層和外胚層中任何一種類型細(xì)胞，因此可用遺傳標(biāo)記的ES細(xì)胞(如標(biāo)記半乳糖苷酶基因)注入囊胚腔，通過組織化學(xué)染色追蹤ES細(xì)胞的分化特點，探索胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞分化、組織和器官形成的規(guī)律。小鼠的ES細(xì)胞

30、已成為研究哺乳動物早期發(fā)育規(guī)律的重要工具之一。,2024/3/24,44,2.在體外研究細(xì)胞的分化規(guī)律 ES細(xì)胞僅在飼養(yǎng)層細(xì)胞上或在添加白血病抑制因子(LIF)或白細(xì)胞介素-6(IL-6)的培養(yǎng)液中維持不分化狀態(tài)。當(dāng)培養(yǎng)液中添加分化誘導(dǎo)劑，如牛黃酸(RA)、二甲基亞砜(DMSO)、丁酰環(huán)腺苷酸和3-甲氧基苯甲酰胺等，可誘導(dǎo)ES細(xì)胞發(fā)生不同類型的分化，通過研究ES的分化特點可揭示細(xì)胞分化和凋亡機理。,2024/3/24,45,

31、3.用于研究基因的功能和制備基因敲除動物 由于用ES細(xì)胞可進(jìn)行基因打靶，容易獲得基因敲除或定向插入外源基因的ES細(xì)胞，因此是基因敲除和基因插入的首選細(xì)胞。 通過篩選獲得陽性細(xì)胞，然后用嵌合體或細(xì)胞核移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因動物。用于研究未知基因的生物學(xué)功能。,2024/3/24,46,4. 治療人類的某些難治性疾病 人類由于細(xì)胞壞死、退化或功能異常引起的疾病，如帕金森綜合癥、少年糖尿病和老年癡呆癥等，已成為

32、醫(yī)學(xué)上尚未攻克的頑癥。利用ES細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化形成新的組織細(xì)胞的特性，移植ES細(xì)胞可使壞死或退化的部位得以修復(fù)并恢復(fù)正常功能。目前，在動物實驗方面，用ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化出的某些組織細(xì)胞已成功地治愈糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑難病癥。,2024/3/24,47,5.培育出人造組織器官，用于器官移植 隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，通過ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化，還可以培育出人造組織器官，解決目前臨床上存在的供體器官不足和器官移植后免疫

33、排斥的問題。,2024/3/24,48,三、成體干細(xì)胞1. 成體干細(xì)胞（AS細(xì)胞）的來源 AS細(xì)胞位于出生后體內(nèi)分化成熟的組織之中，具有自我更新和分化潛能，它在分裂時可產(chǎn)生兩個子代細(xì)胞，一個與原來干細(xì)胞完全一致，另一個向前分化，形成相應(yīng)組織的多功能干細(xì)胞，通過分化增殖和更新衰老細(xì)胞來構(gòu)筑相應(yīng)的器官，維持正常生理功能?，F(xiàn)在可從骨髓和血液、胎盤、臍帶、肌肉、大腦、皮膚、脂肪、滑膜等多種組織中獲取各種多能干細(xì)胞。,2024/3/24,4

34、9,2.AS細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)定向分化取所要分離AS細(xì)胞的組織，用酶消化法分散細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。再用各種技術(shù)從體外培養(yǎng)細(xì)胞中分離AS細(xì)胞，如用免疫磁珠分離系統(tǒng)分離乳腺AS細(xì)胞。同ES細(xì)胞一樣，AS細(xì)胞的誘導(dǎo)定向分化需要細(xì)胞因子、激素等刺激，如IL-l、IL-11、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）等。通常情況下，供體干細(xì)胞在受體中分化為與其組織來源一致的細(xì)胞。然而在某些情況下干細(xì)胞的分化并不遵循這種規(guī)律，如神經(jīng)外胚層來源的NSC能

35、分化為中胚層來源的細(xì)胞如肌細(xì)胞，肌肉干細(xì)胞會分化為各種血細(xì)胞系等。所有干細(xì)胞中，來源于骨髓的干細(xì)胞在多向性分化方面具有較大的潛能，分為造血干細(xì)胞(HSC)和骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。,2024/3/24,50,3.AS細(xì)胞的鑒定 各種AS細(xì)胞都有自己的標(biāo)記物，可利用標(biāo)記物進(jìn)行鑒定。4.AS細(xì)胞的應(yīng)用 疾病的替代治療和移植治療 如用造血干細(xì)胞治療白血病，將造血干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞來修復(fù)受損傷的心肌，治療心力衰竭。

36、骨髓來源干細(xì)胞及其他來源干細(xì)胞都可以分化得到成骨細(xì)胞，通過將細(xì)胞與支架材料結(jié)合后移植于骨骼受損部位，用于修復(fù)骨骼缺損。,2024/3/24,51,四、誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞1.iPS細(xì)胞的來源iPS 細(xì)胞建立的過程主要包括:① 分離和培養(yǎng)宿主細(xì)胞；② 通過病毒介導(dǎo)或基因轉(zhuǎn)染的方式將若干個多能性相關(guān)的基因（Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4）導(dǎo)入宿主細(xì)胞；③ 將基因?qū)氲募?xì)胞種植于飼養(yǎng)層細(xì)胞上, 用ES細(xì)胞專用培養(yǎng)體系中培養(yǎng)

37、, 同時在培養(yǎng)液中根據(jù)需要加入相應(yīng)的小分子化合物，以促進(jìn)重編程。2.iPS細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)定向分化 其培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)定向分化的條件基本與ES細(xì)胞相同。3.iPS細(xì)胞的鑒定 iPS 細(xì)胞的鑒定與ES細(xì)胞相同。,2024/3/24,52,2024/3/24,53,以病毒為載體，向老鼠的成纖維細(xì)胞中注入4個基因，將其改造為ｉＰＳ細(xì)胞，然后在此基礎(chǔ)上培育出一個老鼠胚胎，再把它植入代孕實驗鼠的體內(nèi)。20天后，一只黑色的小老鼠出生。,再

38、生醫(yī)學(xué)中如何獲得病人ES細(xì)胞傳統(tǒng)技術(shù) 1.用病人的皮膚細(xì)胞核移植到人去核卵母細(xì)胞 人卵母細(xì)胞來源問題2.用病人的皮膚細(xì)胞核移植到動物去核卵母細(xì)胞 倫理問題新技術(shù)1.用ES細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄基因?qū)肴似つw細(xì)胞，直接轉(zhuǎn)化成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）(2007年） 安全問題2.miRNAs直接將皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPS(2010年）3.4種小分子化合物組合直接轉(zhuǎn)化體細(xì)胞為CiPS（2013年）,4.iPS細(xì)胞的應(yīng)用iPS

39、細(xì)胞與ES細(xì)胞相比,具有很多優(yōu)勢。iPS細(xì)胞的來源更方便、更豐富，可以通過有限的幾個轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)染，或相關(guān)RNA導(dǎo)入，或用小分子化合物直接誘導(dǎo)各種不同動物的體細(xì)胞來獲取多能性干細(xì)胞，而不需要通過ES細(xì)胞途徑，克服了許多動物至今未分離出ES細(xì)胞的問題。iPS細(xì)胞的產(chǎn)生不需要早期胚胎或者其他配子的參與，克服了使用人胚胎進(jìn)行實驗的倫理問題，可見iPS細(xì)胞必然成為未來相當(dāng)長一段時間內(nèi)的研究熱點。目前, 科學(xué)家們已經(jīng)成功地從小鼠、大鼠、獼

40、猴、豬和人的體細(xì)胞中誘導(dǎo)并獲得iPS 細(xì)胞。,2024/3/24,54,近期利用干細(xì)胞進(jìn)行再生醫(yī)學(xué)動物實驗和臨床試驗的研究報導(dǎo),2013.1.28 日本科學(xué)家利用iPS細(xì)胞成功再生毛囊日本慶應(yīng)義塾大學(xué)的一個研究小組利用人類誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞），在實驗鼠身體上成功再生了部分毛囊，為治療脫發(fā)癥開辟了新道路。2013.5.15 日本科學(xué)家利用iPS細(xì)胞制成造血干細(xì)胞 有望取代骨髓移植日本東京大學(xué)的研究人員利用能發(fā)育成各種細(xì)胞的

41、誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）制作出造血干細(xì)胞，并能生成淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞等正常的血液細(xì)胞。這一成果有助開發(fā)替代骨髓移植的血液病治療新方法。2013.7.18中國科學(xué)家用小分子化合物誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為iPS《Science》 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鄧宏魁教授和趙揚博士帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊用小分子化合物誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞。該成果開辟了一條全新的實現(xiàn)體細(xì)胞重編程的途徑，給未來應(yīng)用再生醫(yī)學(xué)治療重大疾病帶來了新的可能。2

42、013.10.14美國科學(xué)家成功利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞制造血管《分子治療》美國麻省總醫(yī)院的科學(xué)家發(fā)明一種新方法，成功將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPS）轉(zhuǎn)化為血管，并在實驗動物中長時間存活工作。該方法被認(rèn)為是利用再生醫(yī)學(xué)技術(shù)解決血管疾病問題的一項里程碑式成果。2013.12.3 美國科學(xué)家首次將iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)化為功能性肺細(xì)胞《自然 生物技術(shù)》美國哥倫比亞大學(xué)醫(yī)學(xué)研究中心的科學(xué)家首次成功地將人體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成了功能性的肺細(xì)胞和呼吸道細(xì)胞。這一最新

43、成果可以幫助科學(xué)家們研究肺部發(fā)育、構(gòu)建肺部疾病建模、篩查藥物并最終制造出可供移植的肺部器官。2013.12.28澳大利亞昆士蘭大學(xué)采用干細(xì)胞成功地培育出了腎臟《自然 細(xì)胞生物學(xué)》研究人員設(shè)計出一種促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞在盤碟中形成自我組裝成微型腎臟（mini-kidney）所需的所有細(xì)胞類型。,2024/3/24,55,2014.7.1 日本科學(xué)家用誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞治療肌萎縮側(cè)索硬化癥日本京都大學(xué)教授井上治久率領(lǐng)的研究小組，利用iPS細(xì)

44、胞制作出可變化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的前驅(qū)細(xì)胞，然后向24只患有漸凍癥的實驗鼠脊髓各移植了約8萬個這種細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植了前驅(qū)細(xì)胞的24只漸凍癥實驗鼠的平均生存期為162天，而沒有移植的24只實驗鼠僅為150天。2014.9.12日本誘導(dǎo)多能干細(xì)胞首次獲批進(jìn)行人體實驗《自然》治療使用的iPS細(xì)胞由日本神戶理化研究所（RIKEN）發(fā)育生物學(xué)中心的眼科專家高橋雅代培育而成，將用于治療與年齡相關(guān)的視網(wǎng)膜退化疾病。高橋雅代從罹患這一疾病的患者那兒

45、提取到了皮膚細(xì)胞，并將其轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞，接著，誘導(dǎo)iPS細(xì)胞變成視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，最后將其培育成能被植入受損視網(wǎng)膜內(nèi)的纖薄層。2014.11.26美國斯坦福大學(xué)和哥倫比亞大學(xué)和奧地利科學(xué)院的科學(xué)家用iPS細(xì)胞治療大皰性表皮松解癥《科學(xué) 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》取患者的皮膚細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，用病毒將矯正性的基因送入細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞移植回患者腿部。這些細(xì)胞移植到小鼠身上之后，長成了人類皮膚，也生產(chǎn)了正確的膠原蛋白。2014.11

46、.27日本科學(xué)家首次用成體干細(xì)胞培養(yǎng)出腎臟組織《干細(xì)胞》日本岡山大學(xué)和杏林大學(xué)的研究人員從成年實驗鼠腎臟內(nèi)采集了成體干細(xì)胞，在培養(yǎng)皿內(nèi)制作出細(xì)胞團(tuán)塊，然后將細(xì)胞團(tuán)塊放入凝膠狀物質(zhì)中，再加入促其生長的特殊蛋白質(zhì)。3至4周后，他們培養(yǎng)出了50至100個類似腎單位的立體管狀組織。這些組織中含有腎小管和腎小球等結(jié)構(gòu)，并具有部分腎臟的功能。2014.11.29日本科學(xué)家利用iPS細(xì)胞修復(fù)肌肉萎縮癥基因《干細(xì)胞報告》日本京都大學(xué)研究人員利用誘

47、導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞），成功修復(fù)了引發(fā)肌肉萎縮癥的致病基因。這一成果將有望促進(jìn)開發(fā)出改善肌肉萎縮癥癥狀的方法。,2024/3/24,56,2015.8.6中國科學(xué)家使用小分子化合物直接誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞重編程獲得功能神經(jīng)元《Cell Stem Cell》 北京大學(xué)生命中心鄧宏魁研究組取得的一項重要研究成果：使用小分子化合物組合直接將小鼠成纖維細(xì)胞重編程成為了功能神經(jīng)元。整個誘導(dǎo)過程不經(jīng)歷多潛能干細(xì)胞階段和細(xì)胞增殖過

48、程。該方法相比較傳統(tǒng)的先誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程獲得多潛能干細(xì)胞，再分化獲得功能細(xì)胞方法，直接重編程方法更加簡單和直接，并有可能應(yīng)用于體內(nèi)直接重編程，成為一種新的治療疾病的解決方案。2015.10.8澳大利亞與荷蘭科學(xué)家用iPS培育出腎臟組織《自然》 澳大利亞與荷蘭研究人員從誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPS)中，培育出“類似腎臟的組織”。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞是重新設(shè)定為中性狀態(tài)的成體細(xì)胞，接著它們再受誘發(fā)分化成其他類型的細(xì)胞。2015.

49、11.11中國科學(xué)家用ES細(xì)胞治療阿爾茨海默?。ˋD）動物模型《干細(xì)胞報告》 中科院上海生科院生化與細(xì)胞所景乃禾研究組成功地把小鼠和人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的功能性基底前腦膽堿能神經(jīng)元（BFCN），將這些干細(xì)胞來源的BFCN移植到阿爾茨海默?。ˋD）動物模型腦內(nèi)，可以有效改善模型小鼠的認(rèn)知功能。2015.11.20 日本科學(xué)家用iPS細(xì)胞育成心臟組織薄膜《Scientific Reports》

50、 日本京都大學(xué)iPS細(xì)胞研究所山下潤教授所帶領(lǐng)的研究小組近日宣布，他們成功開發(fā)出能夠延長“心臟組織薄膜”作用時間的新方法。心臟組織薄膜是該團(tuán)隊在2014年利用人類誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)制作的多層疊加細(xì)胞層，通過將其移植到心臟外可改善心臟功能。,2024/3/24,57,第五節(jié) 外源基因?qū)肱咛ゼ夹g(shù),2024/3/24,58,將外源基因?qū)氲脚咛?nèi)主要有以下幾種方法：一、直接導(dǎo)入受精卵或早期胚胎內(nèi) ① 顯微注射法：

51、 在顯微鏡下利用玻璃顯微注射針將外源DNA片段直接注入到受體的受精卵雄性原核內(nèi)。 ② 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法： 將外源基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，感染受體細(xì)胞時，外源基因可整合到宿主細(xì)胞染色體內(nèi)。用于轉(zhuǎn)基因和基因治療。 ③ 精子載體法： 將外源DNA片段與動物精子一起孵育，在體外受精過程中由精子將外源DNA帶入卵內(nèi)。,2024/3/24,59,二、將外源基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞或體細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為供體核移植到去核卵母

52、細(xì)胞，發(fā)育成胚胎。 1.將外源基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞或體細(xì)胞： ① 電穿孔法：細(xì)胞暴露于高電壓時，細(xì)胞膜為高電壓瞬時擊穿，從而使外源DNA片段被攝入細(xì)胞中。 ② 脂質(zhì)體法：脂質(zhì)體是一種人造膜，將外源DNA裝入脂質(zhì)體，與培養(yǎng)細(xì)胞一起溫育，即可將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。 ③ 基因槍法： ④ DEAE-葡聚糖介導(dǎo)法： ⑤ 磷酸鈣介導(dǎo)法：,2024/3/24,60,2.帶有外源基因的ES細(xì)胞通過崁合體技術(shù)進(jìn)入囊胚胚胎嵌合是指

53、將遺傳上不同的兩類胚胎或胚細(xì)胞組合起來，形成一個胚胎，由此而發(fā)育形成的動物稱為嵌合體動物。由于嵌合體動物是兩類遺傳背景不同的胚胎發(fā)育形成的，不同細(xì)胞群體互相嵌合構(gòu)成了器官和組織，但嵌合體動物攜帶的兩種遺傳特性不能同時遺傳給下一代的同一個體。究竟哪一個親本的遺傳特性能遺傳取決于該親本的細(xì)胞是否在嵌合體動物體內(nèi)分化成生殖細(xì)胞（精子或卵子）。分化成生殖細(xì)胞的親本的遺傳特性能傳給后代。,2024/3/24,61,,2024/3/24,62,嵌

54、合體動物的制備：1.聚合法 用聚合法制作嵌合體動物，是將遺傳上不同（例如毛色不同）的兩個8～16細(xì)胞胚胎用物理方法聚合起來。2.注射法 注射法是將胚胎干細(xì)胞或其他胚細(xì)胞注入桑椹胚或囊胚腔中來制作嵌合體動物。,3.帶有外源基因的體細(xì)胞通過克隆技術(shù)進(jìn)入胚胎將帶有外源基因的體細(xì)胞作為供體，通過核移植技術(shù)克隆到去核卵母細(xì)胞，在體外發(fā)育成囊胚，再移植到假孕動物的子宮中。出生后動物的基因型與供體的基因型完全一致。,2024/3/24,63

55、,2024/3/24,64,外源基因進(jìn)入胚胎的途徑和方法,外源基因進(jìn)入細(xì)胞后的命運 外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后有三種命運： 1．被胞內(nèi)核酸酶降解。 2．以游離狀態(tài)存在。游離的未整合外源DNA只要有真核細(xì)胞能識別的啟動子、編碼基因以及poly(A)信號等，一般都能得到表達(dá)，但隨著細(xì)胞衰老，表達(dá)力下降。這種表達(dá)不能傳代，稱為暫時表達(dá)。 3．整合到受體細(xì)胞染色體（只有少數(shù)）。整合到受體細(xì)胞基因組的外源基因，能隨細(xì)胞分裂遺傳到子細(xì)胞，

56、稱為穩(wěn)定表達(dá)。,2024/3/24,65,外源基因整合到受體細(xì)胞染色體可分為以下兩種情況： ① 隨機插入（Random insertion）：外源基因進(jìn)入細(xì)胞后，隨機插入到任意的染色體內(nèi)。如果插入到一個基因內(nèi)，可能導(dǎo)致該基因的失活。另外，插入外源基因受鄰近調(diào)控序列的影響，其表達(dá)可能高，也可能低。 ② 定點整合（Targeted integration）：實現(xiàn)定點整合的前提是外源基因的一端或兩端帶有定點整合部位的同源DNA序列，即

57、所謂的同源臂（Homologous arm）。當(dāng)外源基因載體進(jìn)入細(xì)胞后，同源臂序列與宿主染色體上的相同序列相互靠近，通過同源重組，將外源基因載體置換到染色體相應(yīng)的位置上，實現(xiàn)了定點整合。我們把這種技術(shù)形象地稱之為“基因打靶”。,2024/3/24,66,隨機整合（Random insertion） 外源基因隨機插入到染色體的任意部位。 插入到致死基因序列內(nèi)：胚胎死亡 插入到功能基因序列內(nèi)：基因失活 插入到調(diào)

58、控區(qū)下游：外源基因表達(dá)增強/減弱,2024/3/24,67,定點整合（targeted integration）同義詞：基因打靶（Gene targeting） 是指將基因組的某一基因序列克隆出來并加以改造，再導(dǎo)入同種細(xì)胞內(nèi)。該基因序列可以與細(xì)胞基因組內(nèi)的同源序列（靶基因）發(fā)生重組，從而將改造后的基因置換到基因組內(nèi)，實現(xiàn)靶基因敲除、替換或改造。,2024/3/24,68,同源重組（Homologous recombin

59、ation） 是指發(fā)生在DNA同源序列之間的重組，其條件是兩條DNA分子有相同序列部分，并且互相接近。,2024/3/24,69,2024/3/24,70,DNA構(gòu)件導(dǎo)入細(xì)胞后整合的方式,如何在體外篩選定點整合的供體細(xì)胞和ES細(xì)胞？采用正負(fù)篩選法 正篩選：用Neor基因（新霉素抗性基因） 培養(yǎng)液中G418可殺死沒有Neor基因的細(xì)胞 負(fù)篩選：用tk基因（ HSV胸腺激酶基因） 有

60、tk基因的細(xì)胞可使培養(yǎng)液中的Ganc轉(zhuǎn)變成一 種有毒物質(zhì)使細(xì)胞死亡。對通過正負(fù)篩選法篩選存活的細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，篩選出定點整合的細(xì)胞。,2024/3/24,71,用正負(fù)篩選法篩選定點整合細(xì)胞 正篩選用Neor基因：新霉素抗性基因 當(dāng)帶有Neor基因的打靶載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，未整合Neor基因的細(xì)胞被培養(yǎng)液中的G418（新霉素的衍生物）殺死，而整合到宿主細(xì)胞的Neor基因?qū)ε囵B(yǎng)液中的G418產(chǎn)生耐藥