病理切片技術(shù)-學(xué)術(shù)報(bào)告

1、病理切片技術(shù),目錄,一、取材二、固定三、脫水四、透明五、浸蠟六、包埋七、切片八、染色,一、取材,取材是制作切片程序中的首要步驟，取材不當(dāng)，將直接影響病理診斷和科研工作的效果。組織標(biāo)本的選用非常重要，不能隨意的切取組織來制作組織切片，否則病理檢驗(yàn)的結(jié)果是不會令人滿意的。,取材工具：取材刀具必須鋒利。切取標(biāo)本不應(yīng)該擠壓和揉擦，以免損害組織造成人為組織變化，給診斷帶來困難或?qū)е洛e診，漏診。,標(biāo)本的選?。簯?yīng)選擇病變或可疑病變的組織

2、。必要時(shí)選取病變與正常組織交界處。組織宜小不宜大，以不超過24x24mm2為佳，厚度以3—5mm為度，過大過厚會影響對標(biāo)本的固定，另方面也影響切片的制作。特殊目的者應(yīng)屬例外。,二、固定,在組織病理學(xué)中，不管是組織切片乃至電鏡還是大體標(biāo)本的保存，都必須進(jìn)行及時(shí)的適當(dāng)?shù)暮陀行У墓潭ā＝M織只有經(jīng)過固定，才能完成隨后的一系列的制作，直至切片的最后完成。,1.固定的作用,固定的作用，從組織學(xué)的角度其簡單的定義是：保持細(xì)胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，使

3、之盡量保持細(xì)胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)。從免疫組化技術(shù)的角度，使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，盡量減少或終止外源性酶和內(nèi)源性酶的反應(yīng)；防止細(xì)胞的自溶，以免使抗原擴(kuò)散至組織間質(zhì)；保持組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)；保持組織或細(xì)胞的抗原性。,2.固定的目的,能防止細(xì)菌的腐蝕和組織的自溶。 保存細(xì)胞固有的物質(zhì)，能凝固或沉淀細(xì)胞內(nèi)或組織液，糖原等，使細(xì)胞或組織基本上保持與生活時(shí)的物質(zhì)一樣。 使組織硬化，便于切塊。 對某些具有傳染性的標(biāo)本，能防止疾病的擴(kuò)散。保

4、存好大體標(biāo)本?？稍鰪?qiáng)染色的作用。,3.固定的注意事項(xiàng),組織固定越新鮮越好 組織固定，組織塊不宜過大 對不同類型的組織應(yīng)適當(dāng)合理地選擇固定液 組織固定，時(shí)間不宜太短，也不宜太長 固定液的量要充分 特殊病例或特殊物質(zhì)應(yīng)選擇特殊的固定液 組織的第二次固定或后固定,4.固定液的使用,根據(jù)Bencroft的分類法，可分為四種類型：醛類：甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。氧化劑類：四氧化鋨，高錳酸鉀，重鉻酸鉀等。

5、蛋白變性類：甲醇，乙醇，醋酸等。其他：氯化汞，苦味酸等。上述四種類型的固定劑，最常使用的是甲醛，其余的也在其它病理技術(shù)方面中用到。,沖洗組織經(jīng)過固定后，脫水之前應(yīng)進(jìn)行沖洗，將組織內(nèi)的固定液洗干凈，否則殘留組織內(nèi)的固定液有礙制片和染色，而有些固定液則可在組織中繼續(xù)起到脆化組織的作用，以至于損壞組織，給制片工作帶來不利。在沖洗時(shí)，沖洗劑的選擇應(yīng)依固定液的種類和性質(zhì)而有所不同。,沖洗時(shí)應(yīng)注意以下事項(xiàng)：水溶性的固定劑：需用流水沖洗。酒精

6、溶劑的固定劑：應(yīng)用同濃度的酒精浸洗。含苦味酸的固定劑：（苦味酸與甲醛混合液除外），須用70％酒精浸洗。含有升汞固定劑：水或酒精中加碘以洗去組織內(nèi)汞的沉淀。含有鉻酸的固定劑：沖洗時(shí)置于暗處，以免產(chǎn)生沉淀或使組織硬化而影響制片。,三、脫水,脫水就是用脫水劑完全除去組織內(nèi)的水分，為下一步透明及浸蠟創(chuàng)造條件。此外，脫水還可以使組織再次發(fā)生一定的硬化，脫水劑必須是與水在任何比例下均能混合的液體。,1.常用的脫水劑,酒精 （常用）丙酮(Ac

7、etone) 正丁醇(γ-Buty alcohol) 二氧乙環(huán)(Dioxan),2.組織的搖震,為加快脫水進(jìn)程可將標(biāo)本放入各級酒精內(nèi)借助機(jī)器或手工震搖，還可以加溫促進(jìn)脫水。即將標(biāo)本裝在塞緊的玻璃瓶置于包埋箱或溫箱內(nèi)，因液體受熱產(chǎn)生的正壓可增加溶液的對流。但熱酒精會使組織過硬，并有爆裂危險(xiǎn)，除急診外，最好不用此方法。,四、透明,目的是使石蠟滲透到組織中去，達(dá)到包埋的支持作用。 將組織投入可以同酒精又能同石蠟相混合的媒劑 中，組織中的

8、酒精就被該媒劑取代，待酒精完全被該媒劑完全取代后，組織即成透明狀態(tài) 透明后就可以將組織浸入溶解的石蠟進(jìn)行浸蠟,透明劑二甲苯：能與酒精，丙酮相混合，又是石蠟的溶劑。 對組織的收縮性強(qiáng)，作用迅速，組織在二 甲苯中時(shí)間不宜過長 。(常用)氯 仿：作用緩和 ，不易呈現(xiàn)透明現(xiàn)象 香柏油：處理細(xì)柔組織的最佳透明劑 。,五、浸蠟,組織經(jīng)媒劑的透明作用之后，移入熔

9、化的石蠟內(nèi)浸漬，石蠟逐漸浸入組織間隙，取代透明劑，這一程序就叫浸蠟。 石蠟的質(zhì)量和熔度與切片質(zhì)量密切相關(guān) 。為了增加石蠟的韌性，可在石蠟中加入一些混合劑，常用蜂蠟，硬脂酸，松香等。,六、包埋,包埋，就是將已經(jīng)經(jīng)過固定，脫水，透明，浸蠟的組織塊從最后的蠟浴取出置入充滿熔融石蠟的包埋框內(nèi)，包埋成塊，使組織和包埋劑相熔一體并迅速冷卻，這個(gè)程序稱為包埋。包埋劑凝固后，進(jìn)一步加強(qiáng)了組織的硬度和韌度而便于進(jìn)行切片。,1.石蠟包埋法,包埋的方法有

10、自動包埋機(jī)包埋和手工包埋兩種。 手工包埋法：1.組織浸入石蠟后，包埋前將組織移入包埋用石蠟杯內(nèi)。從恒溫箱取出置于三角架上，其下點(diǎn)燃酒精燈，以保持石蠟的溶解狀態(tài)。2.準(zhǔn)備好包埋框，將包埋用的鑷子在酒精燈上加溫（防止鑷子粘蠟）后，左手持蠟杯，右手把加溫的鑷子放在蠟口（直立狀）倒蠟時(shí)讓石蠟沿鑷子注入包埋框內(nèi)。,3.迅速鑷取組織塊放入包埋框石蠟內(nèi)，切面朝下放正置入框底并輕輕壓平，以保證不再有氣泡。4.待石蠟表面凝固前將標(biāo)簽貼于其上，需注

11、意勿使標(biāo)簽與標(biāo)本混淆，當(dāng)蠟塊冷至蠟面有一層透明蠟?zāi)r(shí)，浸入冷水中迅速使其冷卻，否則蠟內(nèi)常形成結(jié)晶。5.蠟塊完全硬固后除去銅框，以保證蠟徹底凝固，立即修切，準(zhǔn)備制成切片或儲藏備用。,2.石蠟包埋流程,組織取材，固定于福爾馬林?jǐn)?shù)小時(shí)后再換以新鮮福爾馬林固定數(shù)小時(shí)。組織流水沖洗6－12小時(shí)。70％酒精2－4小時(shí)。85％酒精2－4小時(shí)。95％酒精（Ⅰ）2－4小時(shí)。（可過夜）95％酒精（Ⅱ）2－4小時(shí)。（可過夜）,100％酒精（Ⅰ）2

12、－4小時(shí)。100％酒精（Ⅱ）2小時(shí)。二甲苯（Ⅰ）0.5－1小時(shí)。二甲苯（Ⅱ）0.5小時(shí)。浸蠟（Ⅰ）2小時(shí)。浸蠟（Ⅱ）2小時(shí)。組織包埋。（上述只供參考）,七、切片,一般的切片厚度要求在4—6微米。石蠟切片不但可以達(dá)到這個(gè)要求，甚至可以切得更薄到2微米以至1微米。還便于制作大批的或是連續(xù)的切片。以石蠟包埋的組織塊便于長期保存。所以石蠟切片是目前各種切片制作方法中最普通常用的一種方法。,1.切片前的準(zhǔn)備,恒溫水浴鍋首先預(yù)熱至

13、35℃—40℃。蠟塊整修，將蠟塊組織面的石蠟用刀修去，使組織全部暴露出切面并修平，以減少切片刀的磨損。載玻片應(yīng)事先洗滌干凈，無油膩和不透明現(xiàn)象。將鋒利的刀片裝入切片刀夾鉗內(nèi)，調(diào)整角度和位置后隨即緊固。備用小型毛筆、小型無鉤鑷子、鉛筆。,2.切片的步驟,將蠟塊固定于切片機(jī)頭上的夾座內(nèi)，調(diào)整到稍離開切片能夠切到的位置上，注意蠟塊組織切面與切片刀口要垂直平行。再調(diào)整蠟塊組織切面恰好與刀口接觸，旋緊刀架，固定好機(jī)頭。根據(jù)需要調(diào)整切片

14、厚度。,搖動切片機(jī)手輪先進(jìn)行修整切片，直到切出完整的最大組織切面后，再進(jìn)行切制。實(shí)踐中可用右手轉(zhuǎn)動切片機(jī)手輪，左手用毛筆托起蠟片，協(xié)調(diào)地進(jìn)行切片操作。切下的切片帶，一端用鑷子輕輕拉起，應(yīng)盡可能將切片帶拉直展開，用毛筆將切片帶從刀口向上挑起，拉下切片帶，然后輕拖鋪于恒溫水面上。,3.注意事項(xiàng),切片質(zhì)量的好壞，除與技術(shù)熟練程度和切片機(jī)的好壞有關(guān)外，切片刀是決定的因素切片機(jī)的各個(gè)零件和螺絲應(yīng)旋緊，否則將會產(chǎn)生震動 在搖動切片機(jī)時(shí)，用力

15、要求均勻一致 在夏秋季節(jié)進(jìn)行切片時(shí)，應(yīng)使用冰塊加強(qiáng)冷卻,4.貼片,將單張或數(shù)張切片，用鑷子夾住蠟片的一邊并提起，鋪于恒溫水中，（光亮的一面朝下）立即用毛筆輕輕拉展以切片無皺褶為最好。如有皺褶時(shí)用鑷子細(xì)心地逐個(gè)輕輕撥開，注意不可撥破組織。然后分開每張切片，選取其中最完整的，沒有皺褶的切片。,待切片在恒溫水內(nèi)充分?jǐn)傞_展平后，將載玻片垂直插入水中輕靠切片，并用毛筆將切片一邊撥于玻片上，隨即將玻片直立提起，趁玻片上仍有少量水份時(shí)用毛筆，撥正切

16、片位置。如組織較小，可在玻片上多貼幾片或幾排，但排列應(yīng)密集、整齊。用鉛筆在玻片一端的毛玻璃上寫上標(biāo)本編號將附貼好的切片置于恒溫箱內(nèi)干燥（溫度一般高于石蠟熔點(diǎn)2-4 ℃ ）,八、染色,染色就是利用染料在組織切片上給與顏色，使其與組織或細(xì)胞內(nèi)的某種成分發(fā)生作用，經(jīng)過透明后通過光譜吸收和折射，使其各種微細(xì)結(jié)構(gòu)能顯現(xiàn)不同顏色，這樣在顯微鏡下就可顯示出組織細(xì)胞的各種成分。染色劑與組織細(xì)胞相結(jié)合而使組織細(xì)胞著色的過程與物理和化學(xué)作用兩者都有關(guān)系

17、。,1.染色過程,蘇木素浸染 4-10分鐘自來水洗 片刻1％鹽酸乙醇分化 3-5秒鐘自來水沖洗 片刻-數(shù)小時(shí)飽和碳酸鋰溶液 1分鐘自來水沖洗 15分鐘0.5％伊紅酒精浸染 1-2分鐘,95％乙醇1 1-2分鐘95％乙醇2

18、 1-2分鐘100％乙醇1 1-2分鐘100％乙醇2 1-2分鐘二甲苯1 1-2分鐘二甲苯2 1-2分鐘樹膠封片,常規(guī)蘇木素-伊紅染色HE,染液配制1.Harris蘇木素染液配制2.0.5%伊紅酒精染液配制0.5克伊紅溶于100毫升80%酒精中3.1%鹽酸酒精配制1毫升鹽酸溶于99毫升70%酒精中,1克蘇木素溶于10毫升無

19、水酒精中；另將20克鉀明礬加熱溶于200毫升蒸餾水。二者混合煮沸，玻棒攪拌加0.5克氧化汞，流水冷卻，隔夜過濾。,脫蠟二甲苯1 2分鐘二甲苯2 2分鐘95％乙醇 1分鐘95％乙醇 1分鐘自來水洗 片刻,染色：蘇木素浸染 4-10分鐘自來水洗 片刻

20、1％鹽酸乙醇分化 3-5秒鐘自來水沖洗 片刻-數(shù)小時(shí)飽和碳酸鋰溶液 1分鐘自來水沖洗 15分鐘0.5％伊紅酒精浸染 1-2分鐘,脫水，透明，封固95％乙醇1 1-2分鐘95％乙醇2 1-2分鐘100％乙醇1 1-2分鐘100％乙醇2 1-2分鐘二甲苯1

21、 1-2分鐘二甲苯2 1-2分鐘樹膠封片。結(jié)果：胞核呈藍(lán)色，胞漿呈紅色，紅細(xì)胞呈桔紅色，其它成分呈深淺不同紅色。,彈性、膠原纖維的雙重組合染色法,染液配制1.維多利亞藍(lán)染色液的配制2.麗春紅S染色液 0.5%麗春紅15毫升加苦味酸飽和水溶液85毫升,將維多利亞藍(lán)2克，糊精0.5克，間苯二酚4克，蒸餾水200毫升混合加熱煮沸，約5分鐘后，加入煮沸的30%三氯化鐵溶液25毫升

22、，加熱攪拌呈膠體狀，去火冷卻，將濾渣連同濾紙一起在60℃恒溫箱烤干，殘?jiān)噬钏{(lán)色顆粒狀粉末，將其溶于400毫升70%酒精中，加鹽酸4毫升和5克苯酚，放置一周后成熟。,染色方法組織切片脫蠟（同常規(guī)蘇木素-伊紅染色HE）切片入70%酒精沖洗2分鐘切片入維多利亞藍(lán)溶液30分鐘95%酒精分色1-2分鐘水洗2分鐘麗春紅染色2分鐘無水酒精沖洗2次稍干燥后，二甲苯透明，中性樹膠封片,結(jié)果顯示彈性纖維呈藍(lán)綠色，膠原纖維呈紅色，肌肉等背