三種激發(fā)子誘導的過敏性細胞死亡調(diào)控基因的篩選、克隆及功能研究.pdf

1、為了抵抗病原菌的侵染，植物進化出一套可以抑制病原菌擴展的防衛(wèi)機制，使之能識別特定的病原菌，并作出及時、有效的防衛(wèi)反應。植物具有兩種層面的先天免疫系統(tǒng):第一種是基于細胞表面的模式識別受體對病原物相關(guān)分子模式的識別，即病程相關(guān)分子模式(Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMP)，這種模式誘導的防衛(wèi)反應稱為PTI;第二種是植物細胞內(nèi)的R蛋白通過對病原菌釋放在寄主細胞內(nèi)的效應分子的識別而觸發(fā)的免疫防衛(wèi)反

2、應，稱為效應分子觸發(fā)的免疫反應(Effector-triggeredimmunity，ETI)。PAMPs是一類比較保守的微生物物質(zhì)，可以啟動植物體級聯(lián)信號途徑，最終誘發(fā)植物的抗病性。本研究采用病毒誘導基因沉默技術(shù)(Virus-inducedgenesilencing，VIGS)從本氏煙(Nicotianabenthamiana)cDNA文庫中篩選、克隆了參與三種激發(fā)子(Nep1、harpin和INF1)誘導的過敏性細胞死亡(Hyper

3、sensitivecelldeath，HCD)的基因，并對其中一個參與調(diào)控harpin誘導的過敏性細胞死亡的基因NbMADsl進行機制研究。
　　本研究利用PVX病毒表達載體構(gòu)建了本氏煙cDNA文庫，通過農(nóng)桿菌Gv3101接種沉默煙草，從2500顆煙草中篩選到16個參與不同激發(fā)子誘導的過敏性細胞死亡的基因和3個沉默后影響煙草生長的基因，通過在網(wǎng)站上比對，其中12個與已知基因有較高的同源性。其中編號為Nb2-37的基因編碼煙草中的M

4、ADs-box蛋白，我們從本氏煙中克隆了該基因的全長cDNA，命名為NbMADsl，該基因的沉默可以減弱harpin誘導的HR;Nb34-22和Nb34-3兩個克隆分別編碼依賴于ATP的蛋白酶和UDP-D-木糖合酶，兩者沉默后均能使煙草矮化;克隆Nb16-5編碼ADP-核糖基化因子，該基因沉默后本氏煙死亡。上述結(jié)果表明，利用煙草cDNA文庫并采用VIGS技術(shù)沉默煙草并注射激發(fā)子，可篩選并克隆參與不同激發(fā)子誘導的過敏性細胞死亡的調(diào)控基因，

5、并為揭示激發(fā)子誘導的植物防衛(wèi)反應分子機制提供試驗依據(jù)。
　　從本氏煙cDNA文庫中篩選到一個調(diào)控激發(fā)子誘導的過敏性細胞死亡的基因NbMADS1，通過Nep1、harpin和INF1的注射發(fā)現(xiàn)該基因沉默能減弱harpin誘導的HCD，但不影響Nep1和INF1誘導的HCD。ⅣbMADsl基因沉默削弱了激發(fā)子harpin誘發(fā)的H2O2積累，抑制了harpin誘導的氣孔關(guān)閉和保衛(wèi)細胞中NO的積累，但是對激發(fā)子Nep1和INF1誘導的HR

6、、AOS、NO及氣孔關(guān)閉均沒有影響，這表明不同激發(fā)子誘導氣孔關(guān)閉、NO和H2O2積累的機制存在差異。大量研究表明，MADs-box基因家族參與了植物花器官的分化和下游基因的調(diào)控，但至今沒有關(guān)于該基因家族是否參與植物防衛(wèi)反應的報道。因此本研究對于探究harpin誘導的HR分子機制和MADs-box基因家族是否參與植物防衛(wèi)反應具有重要意義。研究表明NbMADsl基因沉默削弱了激發(fā)子harpin誘發(fā)的H2O2積累，抑制了harpin誘導的氣孔