重金屬誘導(dǎo)長江華溪蟹RNA差異顯示及定量分析.pdf

1、近年來，我國養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，特別是蝦蟹養(yǎng)殖已成為主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，在一些地區(qū)，已經(jīng)成為增加農(nóng)民收入的主要手段。因此，應(yīng)當(dāng)大力加強(qiáng)養(yǎng)殖過程質(zhì)量管理與監(jiān)控，嚴(yán)格控制水體污染，有效限制抗生素和其它化學(xué)藥物的使用，盡量確保養(yǎng)殖水域的適養(yǎng)性和出塘產(chǎn)品的安全性，從生產(chǎn)源頭上保證蝦蟹產(chǎn)品的質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)無公害生產(chǎn)，以此推動(dòng)我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)和健康發(fā)展。然而，經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，工業(yè)污水、生活污水的超量排放，嚴(yán)重污染了養(yǎng)殖用水水源以及養(yǎng)殖自身的污染，也造成水質(zhì)下降，

2、環(huán)境惡化，病害日趨嚴(yán)重，發(fā)病面積逐步擴(kuò)大，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。例如，工農(nóng)業(yè)和人類活動(dòng)排放的大量含有重金屬離子的污水對水域產(chǎn)生威脅。水污染的結(jié)果將導(dǎo)致蝦蟹成活率降低和養(yǎng)殖成本提高，嚴(yán)重影響我國蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和水產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯。因此，研究水環(huán)境中重金屬（例如Cd、Cu）對經(jīng)濟(jì)蝦蟹的影響，不但有助于深入了解和掌握重金屬在生物體內(nèi)的蓄積危害程度，從基因表達(dá)水平上闡明重金屬協(xié)迫對漁業(yè)健康養(yǎng)殖的危害機(jī)理，而且對環(huán)境檢測污染導(dǎo)致的生物體危害提供理論依據(jù)，

3、同時(shí)對豐富甲殼動(dòng)物毒理學(xué)的研究也具有重要意義。
　　長江華溪蟹（Sinopotamonyangtsekiense）隸屬于甲殼綱(Crustaceae)、十足目(Decapoda)、溪蟹科（Potamidae）、華溪蟹屬(Sinopotamon)。華溪蟹是我國淡水蟹類特有屬的代表，種類最多，分布最廣，數(shù)量也最大，見于整個(gè)長江水系及其支流等廣闊地區(qū)的中高山區(qū)及丘陵、平原等不同的生態(tài)區(qū)。本研究以長江華溪蟹為實(shí)驗(yàn)材料，參照國家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)

4、，經(jīng)不同濃度(5mg/L、0.5mg/L、0.05mg/L、0.005mg/L Cd2+和0.1mg/L Cu2+)鎘、銅誘導(dǎo)24h、48h、96h，從分子水平研究在不同組織中積累的選擇性與基因表達(dá)的差異性。一方面，用火焰原子吸收分光光度法測定Cd和Cu在組織中的積累。結(jié)果表明，鎘、銅在體內(nèi)的積累均具有組織特異性，積累量表現(xiàn)出明顯的時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系。積累量由大到小的順序基本是:鰓＞肝胰腺＞心臟。在96h，Cd積累量達(dá)最大值，其中鰓為7

5、5±3.8μg/g，肝胰腺為70±2.9μg/g，但心臟中含量很少且在24h未檢測到。Cu在未處理之前本底含量較高，鰓和肝胰腺中就達(dá)到20.8±1.2μg/g，而心臟中未檢測到。Cd和Cu聯(lián)合染毒后，Cu積累量與對照組相比變化不大，但是Cd的積累量與單獨(dú)Cd處理比較積累量明顯增加。在Cd5mg/L+Cu0.1mg/L染毒96h，Cd積累量在肝胰腺中高達(dá)121.3±3.1μg/g，鰓中101.2±3.4μg/g，心臟中8±0.9μg/g。

6、另一方面，分別提取三種組織的RNA，用RT-PCR技術(shù)合成一鏈cDNA，采用錨定引物與20個(gè)隨機(jī)引物之間組合的PCR反應(yīng)，對染毒前后的mRNA表達(dá)差異進(jìn)行研究，以尋找重金屬應(yīng)答基因。結(jié)果表明，錨定引物與20個(gè)隨機(jī)引物之間組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增差異條帶較多，經(jīng)篩選、再擴(kuò)增并進(jìn)行克隆測序驗(yàn)證其真實(shí)性，得到了應(yīng)答基因的EST序列，提交序列到GenBank中。首次獲得了長江華溪蟹β-actin基因序列，并提交到GenBank中，登錄號為GQ4154

7、18，同時(shí)對七種蟹進(jìn)行了分子系統(tǒng)發(fā)育的初步分析。結(jié)果表明，長江華溪蟹和地蟹（Gecarcinus lateralis）、張口蟹（Neohelice granulata）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，鋸緣青蟹（Scylla serrata）和遠(yuǎn)海梭子蟹（Portunus pelagicus）親緣關(guān)系很近，而中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）和遠(yuǎn)海梭子蟹（Portunus pelagicus）關(guān)系較遠(yuǎn)。用NJ法和ML法構(gòu)建了分子系統(tǒng)樹，得到

8、了相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，長江華溪蟹單獨(dú)形成一支，與其它海洋蟹的親緣關(guān)系遠(yuǎn)，支持溪蟹單獨(dú)劃分為總科。隨后，以SYBR GreenⅠ為染料，β-actin為內(nèi)參，檢測樣本熒光信號的域值循環(huán)數(shù)(Ct)，用Comparative Delta-delta Ct法對三種組織中金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，并用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，隨著Cd濃度升高，MT表達(dá)量也升高。MT表達(dá)

9、在24h增加量較少，48h表達(dá)量急劇升高，且鰓和肝胰腺中增加量高于心臟組織的。Cd濃度5mg/L處理96h，肝胰腺M(fèi)T基因表達(dá)最高增加到22.5倍，但0.05mg/L和0.005mg/L Cd濃度組及對照組MT表達(dá)量變化不明顯。在鎘處理組中加入濃度為0.1mg/L的Cu后，當(dāng)Cd濃度為5 mg/L、0.5 mg/L時(shí)，銅誘導(dǎo)鰓和心臟MT表達(dá)量急劇升高，促進(jìn)效應(yīng)明顯。鰓MT基因表達(dá)量的最大值在5mg/L96h由12.5倍升高到18.36倍

10、。而對于Cd濃度0.05mg/L和0.005mg/L，Cu的促進(jìn)效應(yīng)不明顯。經(jīng)重金屬脅迫后，長江華溪蟹MT基因表達(dá)受時(shí)間影響不明顯，但表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，因而MT可作為監(jiān)測鎘污染的生物標(biāo)識物。結(jié)論如下:
　　1、長江華溪蟹組織中鎘積累量表現(xiàn)出時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系，聯(lián)合染毒后Cd積累量明顯增加。2、mRNA差異顯示結(jié)果初步篩選并獲得了一些重復(fù)性較好的差異條帶，可能為鎘應(yīng)答基因。3、鎘誘導(dǎo)長江華溪蟹MT基因表達(dá)出現(xiàn)清晰的劑量效