藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證

1、第四章 藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證,§4.1 定量分析樣品的前處理方法,概述 含金屬或鹵素的藥物，在分析前需要經(jīng)過不同方法處理后，方可進(jìn)行測(cè)定。處理方法因金屬或鹵素在分子中結(jié)合的牢固程度而異。,一、含鹵素有機(jī)藥物的分析,含鹵素有機(jī)藥物系指藥物分子結(jié)構(gòu)中所含鹵素直接與芳環(huán)或脂肪鏈相連者，而不包括某些有機(jī)藥物的鹵酸鹽或氫鹵酸鹽,結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：C—X,（一）鹵原子的活潑性,1. 鹵原子與碳原子直接相連，鹵原子的活潑性和

2、它直接相連的烴基的結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系,（1）乙烯型鹵和芳鹵 不活潑,（2）烯丙型鹵和芐鹵 活潑,（3）鹵代烷型 介于兩者之間,2. 分子中所含鹵原子的個(gè)數(shù),分子中所含鹵原子的個(gè)數(shù)越多，活潑性越強(qiáng)，特別是同一碳上含多個(gè)鹵原子或一個(gè)苯環(huán)上含多個(gè)鹵原子時(shí)，活潑性增強(qiáng)更加明顯,3. 鹵素的種類,I＞Br＞Cl＞F,常見的含鹵素有機(jī)藥物,三氯叔丁醇防腐藥 鎮(zhèn)痛藥,六氯對(duì)二甲苯廣譜驅(qū)蟲藥,泛影酸X線造

3、影劑,膽影酸X線造影劑,碘他拉酸X線造影劑,碘番酸X線造影劑,碘苯酯X線造影劑,鹽酸胺碘酮抗心律失常藥,諾氟沙星廣譜抗菌藥,醋酸氟輕松腎上腺皮質(zhì)激素類藥，抗炎及抗過敏,磺溴酞鈉實(shí)驗(yàn)診斷用藥 （肝功能）,（二）含鹵素有機(jī)藥物的分析,直接回流后測(cè)定法,堿性或酸性還原后測(cè)定法,氧瓶燃燒分解后測(cè)定法,1. 直接回流后測(cè)定法,本法是將含鹵素有機(jī)藥物溶于適當(dāng)溶劑（如乙醇）中，加入氫氧化鈉溶液（或一定量過量的硝酸銀滴定液）后，加熱回流

4、使其水解，將有機(jī)結(jié)合的鹵素轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)機(jī)的鹵素離子，然后采用銀量法（Volhard法）測(cè)定。,本法適用于含鹵素有機(jī)藥物結(jié)構(gòu)中鹵素原子結(jié)合不牢固的藥物（如鹵原子和脂肪碳原子相連者）。,,原理三氯叔丁醇在NaOH溶液中加熱回流水解，氯元素全部轉(zhuǎn)變成NaCl，用剩余滴定法，即于水解液中加HNO3酸化，再加入定量過量的AgNO3滴定液，使Cl-生成AgCl沉淀，過量的AgNO3，以Fe3+為指示劑，用NH4SCN液回滴定。,例：三氯叔丁醇的

5、測(cè)定 ChP （2005）,（淡棕紅色）,(Ksp=1.56×10–10 ),(Ksp=1.0×10-12 ),Fe3+ + SCNˉ Fe (SCN) 2+,測(cè)定方法 取本品約0.1g，精密稱定，加乙醇5ml溶解后，加20%氫氧化鈉溶液5ml，加熱回流15min，放冷至室溫，加水20ml與硝酸5ml，精密加硝酸銀滴定液(0.1mol/L) 30ml，再

6、加鄰苯二甲酸二丁酯5ml，密塞，強(qiáng)力振搖后，加硫酸鐵銨指示液2ml，用硫氰酸銨滴定液(0.1mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1ml硝酸銀滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于6.216mg的C4H7Cl3O·1/2H2O。,反應(yīng)摩爾比為1∶3,T——滴定度，每1ml滴定液相當(dāng)于被測(cè)組分的mg數(shù)c——滴定液濃度，mol/LM——被測(cè)物的摩爾質(zhì)量，g/moln——1mol樣品消耗滴定液的摩爾數(shù)，常用反應(yīng)摩爾比體現(xiàn)

7、，即反應(yīng)摩爾比為1∶n,2.經(jīng)氧化還原后測(cè)定法 (1)堿性還原后測(cè)定 鹵素結(jié)合于芳環(huán)上時(shí)，由于分子中碘的結(jié)合較牢固，需在堿性溶液中加還原劑（如鋅粉）回流，使碳-碘鍵斷裂，形成無(wú)機(jī)碘化物后測(cè)定。 (2)酸性還原后測(cè)定法,兩法均是將含鹵素有機(jī)藥物在堿性或酸性下，加還原劑（如鋅粉）加熱回流，藥物產(chǎn)生還原裂解反應(yīng)，使有機(jī)結(jié)合的鹵素轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)機(jī)的鹵素離子，然后采用銀量法（Fajans法）測(cè)定。,本法適用于測(cè)定結(jié)構(gòu)中碘與苯環(huán)直

8、接相連，且一個(gè)苯環(huán)上含多個(gè)碘原子的含鹵素有機(jī)藥物。,泛影酸,（1） 堿性還原后測(cè)定法,例 泛影酸的測(cè)定 ChP (2005),取本品約0.4g，精密稱定，加氫氧化鈉溶液30ml與鋅粉1.0g，加熱回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗滌，濾過，燒瓶與濾器用水洗滌3次，每次15ml，洗液與濾液合并，加冰醋酸5ml與曙紅鈉指示液5滴，用硝酸銀滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸銀滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于20.

9、46mg的C11H9 I 3N2O4。,USP (24)、BP（1998）,ChP(2005)收載的膽影酸、碘番酸、膽影葡胺、泛影葡胺、碘他拉酸等均采用同法測(cè)定。,碘番酸,（2）酸性還原后測(cè)定法,取本品的干燥品約0.4g，精密稱定，加鋅粉1g及冰醋酸10ml，加熱回流30min，放冷，冷凝管用水30ml洗滌，用脫脂棉過濾，燒瓶與脫脂棉用水洗滌2次，每次20ml，洗液與濾液合并，加四溴酚酞乙酯指示液1ml ，用硝酸銀滴定液(0.1mol/

10、L)滴定。終點(diǎn)時(shí)黃色沉淀變?yōu)榫G色。每1ml硝酸銀滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于19.031mg的C11H12 I 3NO2。,例 碘番酸的測(cè)定 JP (13),3. 氧瓶燃燒分解后測(cè)定法,（1）原理,氧瓶燃燒法：將有機(jī)藥物放入充滿氧氣的密閉燃燒瓶中進(jìn)行燃燒，并將燃燒所產(chǎn)生的欲測(cè)物質(zhì)吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐?，然后根?jù)欲測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)，采用適宜的分析方法進(jìn)行鑒別、檢查或含量測(cè)定,適用于含鹵素、硫、氮、硒等有機(jī)藥物的分析,本法特點(diǎn)是

11、簡(jiǎn)便、快速、破壞完全，尤其適用于微量樣品的分析,（ 2） 儀器與材料,①儀器裝置 燃燒瓶為500、1000或2000ml無(wú)色、磨口、厚壁、硬質(zhì)玻璃錐型瓶；瓶塞空心，底部熔封鉑絲一根，下端呈螺旋狀或網(wǎng)狀,②稱樣用材料及稱樣 A. 固體樣品 無(wú)灰濾紙 B. 液體樣品 紙袋,C. 軟膏類樣品：將適量樣品置不含被測(cè)成分的蠟油紙中包裹嚴(yán)密，外層再用無(wú)灰濾紙包裹,氧瓶燃燒法裝置與樣品包裝操作圖,④吸收液,A. 作用：

12、吸收液的作用是將樣品經(jīng)燃燒分解所產(chǎn)生的各種價(jià)態(tài)的鹵素、硫、氮、硒等，定量地吸收并轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢ǖ谋阌跍y(cè)定的價(jià)態(tài),③氧氣,B. 吸收液的選擇,氟 水 氯 NaOH溶液溴 H2O2-NaOH NaOH-硫酸肼飽和溶液碘 NaOH－硫酸肼飽和溶液硫 NaOH或H2O2 硒 硝酸溶液,（3）操作方法,①燃燒瓶燃燒前的準(zhǔn)備 用洗液洗凈后，按各藥

13、品項(xiàng)下的規(guī)定加入吸收液，將瓶口用水濕潤(rùn)，小心急速地通入氧氣1min，立即用表面皿覆蓋瓶口。②樣品的準(zhǔn)備 取樣品適量，精密稱定后按規(guī)定方法包裹，固定于鉑絲下端的網(wǎng)內(nèi)或螺旋處。,,③樣品的燃燒 點(diǎn)燃包有供試品的濾紙尾部，迅速放入燃燒瓶中，按緊瓶塞，加水少量封閉瓶口，俟燃燒完畢（應(yīng)無(wú)黑色碎片），充分振搖，使生成的煙霧完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量沖洗瓶塞及鉑絲，合并洗液及吸收液，同法另做空白試驗(yàn)。然后

14、按各藥品項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行鑒別、檢查或含量測(cè)定。,①根據(jù)被燃燒分解的樣品量選用適宜大小的燃燒瓶。,（4）注意事項(xiàng),ChP（2005）規(guī)定的燃燒瓶體積為500、1000或2000ml三種，采用常量或半微量分析,正確選用燃燒瓶的目的在于：樣品能在足夠的氧氣中燃燒分解完全；有利于將燃燒分解產(chǎn)物較快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。,②測(cè)定含氟有機(jī)藥物時(shí)，用石英制燃燒瓶,③鉑絲燃燒時(shí)起催化作用,④應(yīng)同時(shí)做空白試驗(yàn),⑤燃燒時(shí)要注意防爆,

15、⑥燃燒要完全,⑦燃燒產(chǎn)生的煙霧完全被吸收,（5）應(yīng)用,例 磺溴酞鈉的含量測(cè)定 ChP (2005),,燃燒分解,O2,HBr + Na2S + Na2SO4 + …,溴 取本品約0.2g，照氧瓶燃燒法（附錄Ⅶ C）進(jìn)行有機(jī)破壞，選用1000ml燃燒瓶，以0.4%氫氧化鈉溶液10ml，濃過氧化氫溶液0.5ml與水10ml作為吸收液，俟生成的煙霧完全吸入吸收液后，用水稀釋至100ml，煮沸5分鐘，放冷，加稀硝酸使成酸性，精密加

16、硝酸銀滴定液（0.1mol/l）20ml，搖勻，再加硫酸鐵銨指示液2mL，用硫氰酸銨滴定液(0.1mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1mL硝酸銀滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于7.990mg的溴(Br)。,例 碘苯酯的含量測(cè)定 ChP（2005）,原理 碘苯酯系有機(jī)碘化物，用氧瓶燃燒分解，轉(zhuǎn)變?yōu)榈饣?，繼而氧化為游離的I2，并被定量地吸收于吸收液中，和NaOH反應(yīng)，生成I-與IO3-，加入Br2-CH3COOH

17、溶液，使全部轉(zhuǎn)變?yōu)镮O3- ，過量的溴以HCOOH及通空氣去除。加入KI，使與IO3-反應(yīng)析出游離I2，用Na2S2O3液滴定， I2與淀粉結(jié)合所顯的藍(lán)色消失即為終點(diǎn),取本品約20mg，精密稱定，照氧瓶燃燒法進(jìn)行有機(jī)破壞，用氫氧化鈉試液2ml與水l0ml為吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液(取醋酸鉀10g，加冰醋酸適量使溶解，加溴0.4ml，再加冰醋酸使成1000m1)l0ml，密塞，振搖，放置數(shù)分鐘，加甲酸約lml，用水洗滌瓶口，并通

18、入空氣流約3～5min以除去剩余的溴蒸氣，加碘化鉀2g，密塞，搖勻，用硫代硫酸鈉滴定液(0.02 mol/L)滴定，至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每lml的硫代硫酸鈉滴定液(0.02mol/L)相當(dāng)于1.388mg的C19H29IO2。,滴定度的計(jì)算 放大反應(yīng),2mol碘苯酯→1molI21molI2→1molNaIO+1molNaI1molNaIO→1/3molNaIO3

19、+2/3molNaI,即2mol碘苯酯→2molNaIO3,2mol NaIO3+10I-→6molI2,即2mol碘苯酯→1molI2 →6molI2→12molI→12molNa2S2O3,反應(yīng)摩爾比為1∶6,98：140. 氧瓶燃燒法中的裝置有A. 磨口硬質(zhì)玻璃錐形瓶B. 磨口軟質(zhì)玻璃錐形瓶C. 鉑絲D. 鐵絲E. 鋁絲,,,96：133（99x：138）．選擇氧瓶燃燒法所必備的實(shí)驗(yàn)物品A. 磨口硬質(zhì)玻璃錐形瓶B.

20、鉑絲C. 普通濾紙D. 氫氣 E. 無(wú)灰濾紙,,,,99：76．氧瓶燃燒法測(cè)定含氯有機(jī)藥物時(shí)所用的吸收液多數(shù)為A. H2O2溶液B. H2O2—NaOH溶液C. NaOH溶液D．硫酸肼飽和液E. NaOH—硫酸肼飽和液,,99：134. 氧瓶燃燒法可用于A. 含鹵素有機(jī)藥物的含量測(cè)定B. 醚類藥物的含量測(cè)定C. 檢查甾體激素類藥物中的氟D. 檢查甾體激素類藥物中的硒E. 芳酸類藥物的含量測(cè)定,,,,二、含金屬有

21、機(jī)藥物的分析,A. 含金屬的有機(jī)藥物 金屬原子不與碳原子直接相連，通常為有機(jī)酸及酚的金屬鹽或配位化合物，其分子結(jié)構(gòu)中的金屬原子結(jié)合不夠牢固 如酒石酸銻鉀、葡萄糖酸銻鈉、富馬酸亞鐵,酒石酸銻鉀抗血吸蟲病藥,硬脂酸鎂醫(yī)藥片劑的潤(rùn)滑劑和脫模劑,富馬酸亞鐵抗貧血藥,葡萄糖酸銻鈉抗寄生蟲藥 ，治療黑熱病,B. 有機(jī)金屬藥物 金屬原子直接與碳原子以共價(jià)鍵相連，結(jié)合比較牢固。在溶液

22、中一般不解離成離子狀態(tài)。應(yīng)該根據(jù)共價(jià)鍵的牢固程度，經(jīng)適當(dāng)處理，將其金屬轉(zhuǎn)變?yōu)檫m于分析的狀態(tài)，方可進(jìn)行其金屬的鑒別或含量測(cè)定。 如卡巴胂、醋酸苯汞、汞撒利,卡巴胂用于陰道滴蟲病及絲蟲病,醋酸苯汞外用避孕藥,汞撒利利尿及脫水藥，用于心臟性和肝性水腫,含金屬有機(jī)藥物定量分析前的處理方法,不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法 直接測(cè)定法;經(jīng)水解后測(cè)定法;經(jīng)還原-汞齊化后測(cè)定法 經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法 濕法破壞(硝酸-高氯酸法;

23、硝酸-硫酸法;硫酸-硫酸鹽法等);干法破壞；氧瓶燃燒,（一）不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法,1. 直接測(cè)定法,適用于金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬有機(jī)藥物或某些C—M鍵結(jié)合不牢固的有機(jī)金屬藥物。在水溶液中可以電離的藥物。,富馬酸亞鐵的含量測(cè)定 ChP (2005),取本品約0.3g，精密稱定，加稀硫酸 15ml，加熱溶解后，放冷，加新沸過的冷水50ml與鄰二氮菲指示液2 滴，立即用硫酸鈰滴定液(0.1mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果

24、用空白試驗(yàn)校正。每1ml硫酸鈰滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于16.99mg 。,原理,Fe2+ + Ce4+ Ce3+ + Fe2+,2. 用硫酸水解后測(cè)定法,例 硬脂酸鎂的測(cè)定 ChP（2005）,取本品約0.1g，精密稱定，精密加硫酸滴定液(0.05mol/L) 50ml，煮沸至油滴澄清，繼續(xù)加熱10min

25、，放冷至室溫，加甲基橙指示液1~2滴，用氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于2.016mg的MgO。,原理：,某些含汞有機(jī)藥物，由于C—Hg鍵不牢固，在水溶液（冰?。┲械渭恿蛩崾蛊渌?，將有機(jī)汞定量轉(zhuǎn)化成硫酸汞，再用硫氰酸銨滴定液滴定。,例 汞撒利的測(cè)定,取本品約0.5g，精密稱定，加蒸餾水10ml，置冰浴中，滴加硫酸10ml，隨滴隨攪拌，至產(chǎn)生的沉淀復(fù)溶解，再加蒸餾水50ml，硫酸鐵

26、銨指示液2ml，用硫氰酸銨滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫氰酸銨滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于25.29mg的汞撒利。,3. 經(jīng)還原--汞齊化后測(cè)定法,本法系在酸性或堿性溶液中，加鋅粉、加熱回流，將藥物中有機(jī)結(jié)合的汞還原析出金屬汞，并與過量的鋅生成鋅汞齊。將鋅汞齊溶于硝酸后，選用適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定汞的含量，并換算成含汞有機(jī)藥物的含量。,如 醋酸苯汞的含量測(cè)定 取本品約0.5g，精密稱定，置100ml燒瓶中，加水15

27、ml，甲酸5ml與鋅粉1g，附回流冷凝器，煮沸30min。放冷，濾過，濾紙和鋅汞齊用蒸餾水洗滌至洗液對(duì)石蕊試紙不顯酸性反應(yīng)。將鋅汞齊溶解在稀硝酸(1∶2)40ml中，置蒸氣浴上加熱3min，加尿素0.5g和足夠的高錳酸鉀試液至顯桃紅色。冷卻后，加過氧化氫溶液脫色，加硫酸鐵銨指示劑lml，用硫氰酸銨滴定液(0.1mol/L)滴定，即得。每1ml硫氰酸銨液(0.1mol/1)相當(dāng)于16.84mg的C8H8O2Hg。,4.利用藥物中可游離的金

28、屬離子的氧化性測(cè)定含量 例如含銻和含鐵的藥物，在酸性溶液中可游離出具有氧化性的Sb5+ 、Fe3+氧化碘化鉀析出碘，用硫代硫酸鈉滴定。（間接碘量法）。,例 葡萄糖酸銻鈉的測(cè)定 ChP（2005） 取本品約0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水100ml、鹽酸15ml與碘化鉀試液10ml，密塞、振搖后，在暗處?kù)o置10min，用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定，至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至

29、藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每lml的硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于6.088mg的Sb。,例 枸櫞酸鐵銨的測(cè)定 ChP（2005） 取本品約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中。加水15ml溶解后，加硫酸lml，加熱至溶液由暗棕色變成淡黃色，放冷至約15℃，滴加高錳酸鉀試液至溶液顯粉紅色并持續(xù)5s，加鹽酸15ml與碘化鉀試液15ml，密塞，靜置3min，加水50ml稀釋后，用硫代硫酸鈉滴定液(0

30、.1mol/L)滴定至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液2ml，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每lml的硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于5.585mg的Fe。,（二）經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法,適用于金屬原子與碳原子結(jié)合牢固的有機(jī)金屬藥物。 一般包括濕法破壞、干法破壞及氧瓶燃燒法三種方法。,,,,,,,（1）硝酸-高氯酸 消解,消煮時(shí)HNO3具有強(qiáng)的氧化力，熱的濃HClO4是最強(qiáng)的氧化劑和脫水劑，能將組分氧化成高價(jià)

31、態(tài)。加熱時(shí)生成無(wú)水HClO4，可進(jìn)一步與有機(jī)質(zhì)作用，使有機(jī)物很快被氧化分解成簡(jiǎn)單的可溶性化合物，二氧化硅則脫水沉淀。,,,HNO3-HClO4消解樣品是破壞有機(jī)物比較有效的方法，但要嚴(yán)格按照操作程序，防止發(fā)生爆炸。,1. 濕法破壞,本法適用于血、尿、組織等生物樣品的破壞，有機(jī)金屬藥物經(jīng)破壞后，得到的無(wú)機(jī)金屬離子一般呈高價(jià)態(tài)。 本法不能用于含氮雜環(huán)藥物的破壞。此時(shí)宜選用干法灼燒進(jìn)行破壞。 本法破壞能力強(qiáng)，反應(yīng)比較激烈。故進(jìn)行破

32、壞時(shí)，必須嚴(yán)密注意切勿將容器中的內(nèi)容物蒸干，以免發(fā)生爆炸。,,,,,,（2）硝酸-硫酸 消解,,,兩種酸都有較強(qiáng)的氧化能力，其中HNO3沸點(diǎn)低，而H2SO4沸點(diǎn)高（338℃）；熱的濃H2SO4具有強(qiáng)的脫水能力和氧化能力，可以比較快地分解試樣，破壞有機(jī)物；二者結(jié)合使用，可提高消解溫度和消解效果。,,,,,,硝酸-硫酸 消解,常用的HNO3與H2SO4的比例為5:2，消解時(shí)，先將HNO3加入樣品中，加熱蒸發(fā)至小體積，稍冷，再加入H2

33、SO4、HNO3，繼續(xù)加熱蒸發(fā)至冒大量白煙，冷卻，加適量水，溫?zé)崛芙饪扇茺}，若有沉淀應(yīng)過濾。為提高消解效果，常加入少量H2O2。,,,硝酸-硫酸法適用于大多數(shù)有機(jī)物質(zhì)的破壞，如染料、中間體或藥物等。破壞得到的無(wú)機(jī)金屬離子均為高價(jià)態(tài)。 本法不能用于含堿土金屬有機(jī)藥物的破壞 因堿土金屬可與硫酸形成不溶性的硫酸鹽，將會(huì)吸附被測(cè)定的金屬離子，使測(cè)定的結(jié)果偏低。 改用硝酸一高氯酸法,（3） 硫酸-硫酸鹽法 加入濃硫酸

34、作氧化劑 加入硫酸鹽（硫酸鉀或硫酸鈉，因硫酸鈉為含水化合物，不利于有機(jī)破壞，故一般多采用硫酸鉀）加入硫酸鹽目的： 提高硫酸的沸點(diǎn)，增強(qiáng)硫酸的氧化破壞能力，以使樣品破壞完全。 防止硫酸在加熱過程中過早地分解為三氧化硫而損失。 本法常用于含砷或銻有機(jī)藥物的破壞，破壞得到的無(wú)機(jī)金屬離子多為低價(jià)態(tài)。,,,,,,（4）硫酸-磷酸 消解,兩種酸的沸點(diǎn)都比較高，其中H2SO4氧化性較強(qiáng)，H3PO4能與一些金屬離子如Fe

35、3+等絡(luò)合，故二者結(jié)合消解樣品，有利于測(cè)定時(shí)消除Fe3+等離子的干擾。,,,（5） 其它濕法 硝酸—硫酸—高氯酸法 硫酸—氧化劑法（過氧化氫法、高錳酸鉀） 破壞后，金屬呈高價(jià)態(tài),,,,,,,,該方法常用于測(cè)定汞的樣品。KMnO4是強(qiáng)氧化劑，在中性、堿性、酸性條件下都可以氧化有機(jī)物，其氧化產(chǎn)物多為草酸根，但在酸性介質(zhì)中還可繼續(xù)氧化。,,硫酸-高錳酸鉀 消解,,,,,用濃H2SO4-H2O2氧化劑消煮植物樣品時(shí)，其

36、中的有機(jī)物經(jīng)脫水碳化、氧化分解，變成CO2和水，使有機(jī)氮和磷轉(zhuǎn)化為銨鹽和磷酸鹽，可在同一份消煮液中分別測(cè)定全氮、磷、鉀。,總氮、總磷、總鉀的測(cè)定，樣品的消化均采用H2SO4-H2O2消解法進(jìn)行消解。,,,,硫酸-過氧化氫 消解,,,,,多元 消解法,為提高消解效果，在某些情況下需要采用三元以上酸或氧化劑消解體系，混合溶劑具有更強(qiáng)的溶解能力，應(yīng)用廣泛。,,,目的及前提,,,,,,多元 消解法,,,硝酸-硫酸-五氧化二礬消解法,硝酸-

37、氫氟酸-高氯酸消解法,硝酸-硫酸-高錳酸鉀消解法,鹽酸-硝酸-氫氟酸-高氯酸消解法,硝酸-硫酸-高氯酸消解法,注意事項(xiàng)： 1.濕法破壞所用的儀器，一般為硅玻璃或硼玻璃制成的凱氏燒瓶； 2.所用試劑及蒸餾水均不應(yīng)含有被測(cè)金屬離子或干擾測(cè)定的其他金屬離子等組分； 3.由于整個(gè)操作過程所用礦酸量數(shù)倍于樣品，所以必須按相同條件進(jìn)行空白試驗(yàn)校正； 4.操作時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。,樣品的取用量，應(yīng)視被測(cè)含金屬有機(jī)藥物中所含金屬元素的量

38、和破壞后所用測(cè)定方法而定。含金屬元素量在10μg一100μg范圍內(nèi)時(shí)，取樣量為10g;如果測(cè)定方法靈敏度較高，取樣量可相應(yīng)減少。對(duì)于生物樣品，一般血樣10ml一15ml或尿樣50ml,2. 干法破壞,將有機(jī)物灼燒灰化以達(dá)分解的目的。將適量樣品置于瓷、鎳、鉑坩堝中，常加無(wú)水碳酸鈉或輕質(zhì)氧化鎂等以助灰化，混合均勻后，先小火加熱，使樣品完全炭化，然后放入高溫爐中灼燒，使其灰化完全，即可。,適用于濕法不易破壞完全的有機(jī)物（如含氮雜環(huán)

39、類有機(jī)藥物）以及某些不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機(jī)藥物。不適用于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等）有機(jī)藥物的破壞,注意事項(xiàng)： （1）加熱或灼燒時(shí)，應(yīng)控制溫度在420℃以下 （2）一定要灰化完全 （3）經(jīng)本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，但不要輕易棄去,§4.3 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證,一、目的,證明所采用的分析方法適合于相應(yīng)的檢測(cè)要求，方法驗(yàn)證過程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品標(biāo)準(zhǔn)起草和修訂說(shuō)明中。,二、用途,（一）藥品質(zhì)量

40、標(biāo)準(zhǔn)起草時(shí)，分析方法需經(jīng)驗(yàn)證。,（二）藥物合成方法變更、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時(shí)，分析方法需經(jīng)驗(yàn)證。,三、需驗(yàn)證的分析項(xiàng)目,1. 鑒別試驗(yàn)；2. 雜質(zhì)定量或限度檢查；3. 原料或制劑中有效成分含量測(cè)定；4. 制劑中其它成分（降解產(chǎn)物、防腐劑等）的 測(cè)定；5. 溶出度、釋放度等功能檢查中的溶出量等的測(cè)試方法。,準(zhǔn)確度精密度（重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）專屬性檢測(cè)限定量限線性范圍耐用性,四、驗(yàn)證內(nèi)容,（一）

41、 準(zhǔn)確度（accuracy） 準(zhǔn)確度是指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度。 測(cè)定結(jié)果與真實(shí)性的差異 用回收率R（recovery）表示 ①接近100% ②相對(duì)恒定,測(cè)定回收率的具體方法可采用“回收試驗(yàn)法”和“加樣回收試驗(yàn)法”。,回收試驗(yàn) 空白+已知量A的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測(cè)定，測(cè)定值為M,加樣回收試驗(yàn) 已準(zhǔn)確測(cè)定藥物含量P的真

42、實(shí)樣品+已知量A的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測(cè)定，測(cè)定值為M,數(shù)據(jù)要求 規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)，如制備三個(gè)不同濃度樣品各測(cè)三次。 RSD一般在2%以內(nèi)。,1. 含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度,原料藥可用已知純度的對(duì)照品或樣品進(jìn)行測(cè)定，或用本法所得結(jié)果與已建立準(zhǔn)確度的另一方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。,制劑可用含己知量被測(cè)物的各組分混合物進(jìn)行測(cè)定，即采用在空白輔料中加入原料藥對(duì)照品的方法。 如不能得到制劑的全部

43、組分，可向制劑中加入已知量的被測(cè)物進(jìn)行測(cè)定，或與另一個(gè)已建立準(zhǔn)確度的方法比較結(jié)果。,中藥分析的準(zhǔn)確度一般用加樣回收試驗(yàn)衡量。中藥回收率一般要求在95～105%范圍內(nèi)，有些方法操作步驟繁多時(shí)，可要求在90～110%范圍內(nèi)。,2．雜質(zhì)定量測(cè)定的準(zhǔn)確度 可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。如果不能得到雜質(zhì)或降解產(chǎn)物，可用本法測(cè)定結(jié)果與另一成熟的方法進(jìn)行比較。,（二）精密度（precision） 精密度是指

44、在規(guī)定條件下，同一個(gè)均勻樣品，經(jīng)多次（n）取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。 ——系指每次測(cè)定結(jié)果與多次測(cè)定的平均值的偏離程度 用偏差（d）、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)（變異系數(shù)，CV）表示。,方法精密度——表示該分析方法的可重復(fù)性(reproducibility)——反映分析方法的可操作性，是方法驗(yàn)證的基本要點(diǎn)之一,精 密 度,精 密 度,,在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析者測(cè)定結(jié)果的精密度。 (藥典分析

45、方法的建立）,第一章,（1） 重現(xiàn)性 (reproducibility),重現(xiàn)性指采用相同方法，在不同實(shí)驗(yàn)室用同一試驗(yàn)物質(zhì)，由不同操作者使用不同設(shè)備所得試驗(yàn)結(jié)果的一致性。,當(dāng)分析方法將被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時(shí)，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)。 如建立藥典分析方法時(shí)通過協(xié)同檢驗(yàn)得出重現(xiàn)性結(jié)果，協(xié)同檢驗(yàn)的過程、重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說(shuō)明中。,精 密 度,指同一實(shí)驗(yàn)室,不同的時(shí)間由不同分析者或使用不同的儀器進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果的精密度。,第一章,同一實(shí)驗(yàn)室，不同

46、時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備所得結(jié)果的精密度。 考察隨機(jī)變動(dòng)因素的影響。 變動(dòng)因素為不同日期、不同分析人員、不同設(shè)備,精密度,重復(fù)性指采用相同方法，在同一實(shí)驗(yàn)室用同一試驗(yàn)物質(zhì)，同一操作者使用同一設(shè)備，在短時(shí)間間隔內(nèi)，在相互獨(dú)立試驗(yàn)中所獲得結(jié)果的一致性。,第四章,在相同條件,由一個(gè)分析者測(cè)定所得結(jié)果的精密度。,在規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)，如制備三個(gè)不同濃度樣品各測(cè)三次或把被測(cè)物濃度當(dāng)作100%，至少測(cè)6

47、次進(jìn)行評(píng)價(jià)。,精密度,以標(biāo)準(zhǔn)差SD或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD表示。,第四章,表示方法,,絕對(duì)偏差 相對(duì)偏差 d r = ×100% = 平均值,精 密 度,偏差 系指測(cè)得的結(jié)果與平均值之差。 絕對(duì)偏差 d i = 測(cè)得值－平均值 =x i - x （i=1，2，…

48、，n）,,=,=,%,平均偏差,絕對(duì)偏差：?jiǎn)雾?xiàng)測(cè)定與平均值的差值,,,,平均偏差:指單項(xiàng)測(cè)定值與平均值的偏差（取絕對(duì)值）之和，除以測(cè)定次數(shù)。平均偏差是代表一組測(cè)量值中任意數(shù)值的偏差。所以平均偏差不計(jì)正負(fù)。,例1：計(jì)算下面這一組測(cè)量值的平均值（ ），平均偏差（d平均），相對(duì)偏差（d平均 ﹪）55.51,   55.50,   55.46,   55.49, &#

49、160; 55.51,,,解： 平均值 =∑xi/n,平均偏差=∑︱di︱/n=∑︱xi- ︱/n,=(55.51+55.50+55.46+55.49+55.51)/5=55.49,=(0.02+0.01+0.03+0.00+0.02)/5=0.016 平均相對(duì)偏差= ∑ ︱di︱/n ×100% =0.016/55.49×100%

50、 =0.028 ﹪,表示方法,精密度一般用標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，SD或Ｓ)或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)表示若設(shè)供試品的測(cè)定值為Xi，則其平均值為 ，且有n個(gè)測(cè)定值， SD=,RSD= =,——包括批內(nèi)(within-run或intra-assay)RSD—日

51、內(nèi)(within-day) 和批間(between-run或inter-assay)RSD—日間(between -day，day-to-day),標(biāo)準(zhǔn)偏差 是反映一組供試品測(cè)定值的離散的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。,,SX =,=,=,=,=,=,？,2. 測(cè)定法——分別測(cè)定法(Ⅰ),照準(zhǔn)確度項(xiàng)下方法，取空白生物基質(zhì)(如血漿)數(shù)份，分別在同一批內(nèi)和不同批間制備高、中、低 3個(gè)濃度的QC樣品，并分析測(cè)定。批內(nèi)RSD——每一濃度5～6個(gè)樣品

52、，每個(gè)樣品測(cè)定1次，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算3個(gè)濃度及每1濃度的RSD批間RSD——每1分析批內(nèi)每一濃度制備1個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)定1次；用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3個(gè)濃度(每一濃度5～6個(gè)分析批數(shù)據(jù))的RSD,2. 測(cè)定法——連續(xù)測(cè)定法(Ⅱ),若實(shí)際樣品測(cè)定所用的分析批次少于5批，也可進(jìn)行3個(gè)批次的連續(xù)分析(每1濃度的每1批次為5～6個(gè)樣本)——方差分析法 批間RSD =批內(nèi)RSD = =,第四章 分析

53、方法的建立與驗(yàn)證第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求,例2 用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）法檢測(cè)vero-E6，細(xì)胞培養(yǎng)上清正常標(biāo)本10份的結(jié)果（100 × OD490值）為2，3，3，4，4，5，5，5，6，8，求標(biāo)準(zhǔn)差。,解：先計(jì)算　　∑Xi=2+3+3+…+6+8=45　　∑Xi2=22+32+32+…+62+82=229,精密度和準(zhǔn)確度的關(guān)系,準(zhǔn)確度和精密度是兩個(gè)不同的概念，但它們之間有一定的關(guān)系。應(yīng)當(dāng)指出的是，

54、測(cè)定的精密度高，測(cè)定結(jié)果也越接近真實(shí)值。但不能絕對(duì)認(rèn)為精密度高，準(zhǔn)確度也高，因?yàn)橄到y(tǒng)誤差的存在并不影響測(cè)定的精密度，相反，如果沒有較好的精密度，就很少可能獲得較高的準(zhǔn)確度。,（1）精密度是保證準(zhǔn)確度的先決條件。（2）高精密度不一定保證高準(zhǔn)確度。,精密度高準(zhǔn)確度較差，即系統(tǒng)誤差較大；,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,甲,乙,丙,準(zhǔn)確度高，但精密度較差，即偶然誤差較大；,精密度比較好準(zhǔn)確度比較好

55、，稱為精確度高，偶然誤差比較小系統(tǒng)誤差比較小,用打靶時(shí)彈著點(diǎn)為例，說(shuō)明上述二個(gè)詞的意義。用靶心表示其值位置，星點(diǎn)為每次測(cè)得值的位置,偏差（d）：測(cè)量值與平均值之差,標(biāo)準(zhǔn)（偏）差（SD或S）,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)（偏）差（RSD），也稱變異系數(shù)（CV）,（三） 檢測(cè)限（limit of detection， LOD） 檢測(cè)限系指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低量。是限度試驗(yàn)參數(shù)，無(wú)需定量測(cè)定。常用%、ppm、ppb表示。,1．非儀

56、器分析目視法 用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。,2．信噪比法 用于能顯示基線噪音的分析方法（儀器分析方法），是把已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，算出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。一般以信噪比（S/N）3∶1或2∶1時(shí)的相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限。,3．?dāng)?shù)據(jù)要求 應(yīng)附測(cè)試圖譜，說(shuō)明測(cè)試過程和檢測(cè)限結(jié)果。,（四）定量限（1imit of quantitation

57、，LOQ） 指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度。常用%、ppm、ppb表示。,常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為10∶1時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定，也可用儀器所測(cè)空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的10倍為估計(jì)值，再經(jīng)試驗(yàn)確定。,（五）專屬性（specificity） 指有其他成分（雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在情況下采用的方法能準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物的特性，能反

58、映該方法在有共存物時(shí)對(duì)供試物準(zhǔn)確而專屬的測(cè)定能力。是指該法用于復(fù)雜樣品分析時(shí)相互干擾程度的度量。,,能準(zhǔn)確并專一測(cè)出被測(cè)物的能力。是在分析復(fù)雜樣品混合物時(shí)衡量其是否受到干擾及其程度的一種方法。,專 屬 性,藥物分析中考慮:雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、相關(guān)物質(zhì)、制劑輔料。,生物藥物分析中考慮:內(nèi)源性物質(zhì)干擾,代謝產(chǎn)物的干擾,同時(shí)服藥時(shí)的干擾。,（六） 線性(linearity) 在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物濃度直接呈正比關(guān)系的程度

59、。 數(shù)據(jù)要求：應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性圖。,,指在一定的濃度范圍內(nèi),測(cè)試結(jié)果與供試物濃度呈正比關(guān)系的程度。,線 性,第一章,方法 用作圖法或計(jì)算回歸方程建立。 Y=ax+b r=0.999,濃度 應(yīng)包括一定梯度的5-8個(gè)濃度。對(duì)于含量測(cè)定要求濃度上限為樣品最高濃度的120%,下限為樣品最低濃度的80%,但應(yīng)高于LOQ。,（七）范圍 指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性的條件下，測(cè)試方法適用的

60、高低限濃度或量的區(qū)間。,（八） 耐用性 (robusness) 指測(cè)定條件稍有變動(dòng)時(shí)，結(jié)果不受影響的承受程度，為常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。是衡量實(shí)驗(yàn)室和工作人員之間在正常情況下實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性的尺度。,,目的 為常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù). 體現(xiàn)耐用性因素： 被測(cè)溶液的穩(wěn)定性 樣品提取次數(shù) 時(shí)間 試劑來(lái)源,耐 用 性,指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí),分析相同樣品所測(cè)得的試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)程度.,2. 雜質(zhì)的限量檢查除專屬性、檢測(cè)限、耐用性外，

61、其它都不要求。雜質(zhì)的定量測(cè)定除檢測(cè)限外，其它都要求。,3. 含量測(cè)定及溶出量測(cè)定除檢測(cè)限、定量限外，其它都要求。,（九）應(yīng)用 1. 鑒別試驗(yàn)除專屬性、耐用性外，其它都不要求。,不同分析方法對(duì)驗(yàn)證參數(shù)的要求,,,（十）各種含量測(cè)定方法對(duì)效能指標(biāo)的要求 1. 容量分析法： 用原料藥精制品(含量>99.5％)或?qū)φ掌房疾旆椒ǖ木芏?，相?duì)標(biāo)準(zhǔn)差一般應(yīng)不大于0.2％； 進(jìn)行回收率試驗(yàn)?；厥?/p>

62、率一般在99.7～100.3％之間。,2. UV法： 用適當(dāng)濃度的精制品進(jìn)行測(cè)定，其RSD一般不大于1％。制劑的測(cè)定，回收率一般應(yīng)在98％～102％之間。,線性：吸光度A一般在0.2～0.7，濃度點(diǎn)n＝5。用濃度c對(duì)A作線性回歸處理，得一直線方程，r應(yīng)大于0.999(n＝5)，方程的截距應(yīng)近于零。,3. HPLC法： 要求RSD<2％，回收率98％～102％之間。 線性范圍：用精制品配制一系列標(biāo)準(zhǔn)

63、溶液，濃度點(diǎn)n應(yīng)為5～7，用濃度c對(duì)峰高h(yuǎn)或被測(cè)物的響應(yīng)值之比進(jìn)行回歸處理，建立回歸方程，r應(yīng)大于0.999，截距應(yīng)趨于零。,專屬性：要考查輔料、有關(guān)物質(zhì)或降解產(chǎn)物對(duì)主藥的色譜峰是否有干擾，如有干擾應(yīng)設(shè)法排除,99：73. 精密度是指（） A. 測(cè)得的測(cè)量值與真值接近的程度 B. 測(cè)得的一組測(cè)量值彼此符合的程度 C. 表示該法測(cè)量的正確性 D. 在各種正常試驗(yàn)條件下，對(duì)同一 樣品分析所得

64、結(jié)果的準(zhǔn)確程度 E. 對(duì)供試物準(zhǔn)確而專屬的測(cè)定能力,,B,99x：76．精密度是指該法（） A. 測(cè)得的測(cè)量值與真值接近的程度 B. 測(cè)得的測(cè)量值與回收率接近的程度 C. 測(cè)量的正確性 D. 測(cè)得的一組測(cè)量值彼此符合的程度 E. 對(duì)供試物準(zhǔn)確而專屬的測(cè)定能力,D,96：138．在藥物分析中，精密度是表示該法的（ ） A. 測(cè)量值與真值接近程度 B. 一組測(cè)量值彼此符合程度

65、 C. 正確性 D. 重現(xiàn)性 E. 專屬性,,,95：[106—110]應(yīng)要求的效能指標(biāo)： A. 檢測(cè)限 B. 定量限 C. 兩者均要求 D. 兩者均不要求95：106. 含量測(cè)定方法評(píng)估（D）95：107. 雜質(zhì)限量檢查（A）95：108. 雜質(zhì)定量測(cè)定（B）95：109. 溶出度測(cè)定（D）95：110. 中間體含量測(cè)定（D）,97：126．藥物雜質(zhì)檢查所要求的效能指

66、標(biāo)為（ ） A. 準(zhǔn)確度 B. 精密度 C．選擇性 D. 檢測(cè)限 E. 耐用性,,,,98：138．評(píng)價(jià)藥物分析所用的測(cè)定方法的效能指標(biāo)有（ ） A. 含量均勻度 B. 精密度 C. 準(zhǔn)確度 D. 粗放度 E. 溶出度,,,,例[1～5]A．精密度 B．定量限C．兩者皆是 D．兩者皆不是1. 某法測(cè)得一組測(cè)量值

67、間彼此符合程度（A）2. 測(cè)量值和真值接近的程度（D）3. 測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性（A）4. 可定量測(cè)得被測(cè)藥物的最低水平參數(shù)（B）5. 藥物分析方法的效能指標(biāo)（C）,例6. 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差表示（ ）A. 準(zhǔn)確度B. 回收率C. 精密度D. 純凈度E. 限度,,例7. 精密度的一般表示方法有( )A. 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差B. 相對(duì)平均偏差C. 相對(duì)誤差D. 絕對(duì)誤差E. 標(biāo)準(zhǔn)差,,,例8. 檢測(cè)限的表示方法有（ ）A. 百

68、分?jǐn)?shù) B. ppm C. ppbD. µg E. ng,,,,例9. 用信噪比法表示檢測(cè)限時(shí)，信噪比一般應(yīng)為（ ）A. 1∶1 B. 2∶1 C. 3∶1D. 4∶1 E. 5∶1,,,例10. 用碘量法測(cè)定維生素C原料藥時(shí)，要求碘量法應(yīng)具備（ ）A. 選擇性 B. 定量限C. 精密度 D. 粗放度E. 線性,,,,例11. 測(cè)定藥物片劑的溶