乙肝表面抗原的elisa法定量分析方法學驗證-論文

1、<p><b>　　畢業(yè)論文</b></p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　摘要</b></p><p><b>　　關鍵詞</b></p><p><b>　　英文</b></p&g

2、t;<p><b>　　前 言</b></p><p><b>　　1. 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 試劑盒</b></p><p><b>　　1.2 儀器</b></p><p><b>　　1.

3、3 方法</b></p><p>　　1.3.2．鋪板方案</p><p>　　1.3.3．加樣步驟</p><p><b>　　2. 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 標準曲線與線性范圍</p><p>　　2.2 準確度（回收率）的驗證</p><p&

4、gt;　　2.3 精密度的驗證</p><p>　　2.3.1 板內(nèi)精密度的驗證</p><p>　　2.3.2 板間精密度的驗證</p><p>　　2.4 檢測限（LOD）計算</p><p><b>　　3. 討論</b></p><p>　　3.1 乙肝表面抗原定量分析的意義</p&

5、gt;<p>　　3.2 常用定量分析方法</p><p><b>　　3.3 方法概述</b></p><p>　　3.4 方法學驗證內(nèi)容</p><p>　　3.5 結(jié)果分析及應用評價</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p><b

6、>　　致謝</b></p><p><b>　　附錄</b></p><p>　　乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法學驗證</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　目的：對福州藍圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進行方法學驗

7、證，以判斷是否能用于臨床樣本分析。方法：ELISA法定量分析，應用試劑盒HBsAg標準品從濃度為8ng/ml做2倍稀釋的6個濃度梯度做標準曲線，以6，3，1.5ng/ml 3個濃度梯度5復孔做準確度，精密度和檢測限等方法學驗證。結(jié)果：標準曲線R2=0.997，準確度97.07%，1.5ng/ml的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級水平的RSD一般應<15%的要求，檢測限LOD為0.172ng/ml，</p>&

8、lt;p>　　低濃度樣品（<1.5ng/ml）的檢測在準確性和精密度方面都低于高濃度樣品，不適合低濃度樣品的檢測。結(jié)論：該HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒不能用于臨床標本的分析。</p><p><b>　　關鍵詞</b></p><p>　　乙肝表面抗原 ELISA 定量分析 方法學驗證</p><p>　　The

9、reification of the HBsAg ELISA quantitative methodology</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　Object: to verify the quantitative methodology of Fuzhou blueprint biological engineering co

10、mpany to make sure whether it ca be used to the analysis of Clinical Sample. Methods: ELISA quantitative methodology , make an Application of the standard HBsAg kit from the concentration of 8 ng/ml do 2 times diluted si

11、x concentration gradient to constitute a standard curve, testing With 6, 3, 1.5 ng/ml 3 a concentration gradient 5 accurately precise and detection .Results: standard curve ,R2=0.997, the </p><p><b>　　

12、Key words</b></p><p>　　HBsAg Quantitative analysis Verification Methodology.</p><p><b>　　前 言</b></p><p>　　乙肝病毒感染是我國最常見的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清標志物是檢測乙肝病毒感染最主要的病原標志。隨著

13、免疫學技術的不斷發(fā)展，抗原抗體檢測靈敏度明顯提高，使低水平乙肝病毒得以檢出，對臨床診斷及流行病學有重要意義[1]。ELISA法具有較高靈敏度、特異性強、重復性好、可進行定量和半定量測定等優(yōu)點，可以在酶免疫分析儀上做批量檢測。目前臨床上多傾向于做定量分析，若想知道檢驗結(jié)果是否可靠，實驗室則必須對所用試劑盒進行方法學驗證，本實驗對福州藍圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進行準確度，精密度和檢測限等方法學驗證，現(xiàn)報

14、告如下。</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p>　　1.1 試劑盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析試劑盒，福州藍圖生物工程有限公司出品。</p><p><b>　　1.2 儀器</b></p><p>　　酶標儀：Bio-Rad 680 ；洗板機：Bio-Rad 15

15、75；超純水系統(tǒng)：Millipore Elix ；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052)上海精宏實驗設備有限公司；振蕩器（蘇州管械，KJ-201A）；移液器；Tip頭；EP管。</p><p><b>　　1.3 方法</b></p><p>　　1.3.1．溶液配置</p><p>　　1×PBS緩沖液的配置： 稱取8g NaCl、

16、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可。</p><p>　　標準品的配置：原始標準品濃度為8 ng/ml。。取6個2mlEP管，分別標記為S1-S6。50ul/well, 共1孔需50ul，每孔配置60ul備用，按照下表稀釋方案進行稀釋。</p><p>　　質(zhì)控品的配置

17、：50ul/well, 共5復孔需250ul，配置300ul備用，取3個2mlEP管，分別標記為C1，C2，C3，按照下表稀釋方案進行稀釋。</p><p>　　1.3.2．鋪板方案 取出試劑盒中已包被酶標板，取出板條，按照下表鋪板方案進行鋪板在相應孔中依次加入系列標準品、質(zhì)控品及空白對照，每孔50ul?？瞻讓φ占尤?×PBS緩沖液。</p><p>　　1.3.3．加樣步驟&l

18、t;/p><p>　　加入酶標抗體，50 ul/well，震蕩。37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育60min，取出后洗板4次， 加入A、B液, 50 ul/ well，37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育15 min。加入終止液，50 ul/ well。酶標板放入酶標儀，蓋上蓋子，在電腦上打開Microplate Manager 5.2軟件，選擇450nm波長（參照波長630nm），設置LAYOUT和報告模式，測定各孔吸收值。</p

19、><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　　2.1 標準曲線與線性范圍</p><p>　　標準品理論濃度對應的實測OD值</p><p>　　以HBsAg理論濃度為橫坐標，所測OD值為縱坐標作圖，繪制標準曲線觀察線性關系，結(jié)果顯示R2=0.9973，顯示具有良好的相關性</p><p>

20、　　2.2 準確度（回收率）的驗證 </p><p>　　質(zhì)控品理論稀釋濃度對應實測濃度值</p><p>　　質(zhì)控品做了3個濃度梯度，每個濃度做了5個復孔，下表是對每個濃度梯度進行準確度（回收率）的驗證。</p><p>　　結(jié)果顯示HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的平均回收率為97.58%，113.07%，滿足限度要求在85%-115%的范圍內(nèi)，而HBsA

21、g 1.5ng/ml的平均回收率為80.56%，滿足方法定量限在80%-120%的范圍內(nèi)。3個濃度梯度的平均回收率為97.7%，顯示準確性好。</p><p><b>　　2.3精密度的驗證</b></p><p>　　2.3.1 板內(nèi)精密度的驗證</p><p>　　上表中RSD(%)這一參數(shù)表示相對標準偏差，也就是變異系數(shù)CV值，HBsAg

22、 6ng/ml的5個復孔的變異系數(shù)CV值為12.73%，顯示孔間差異較大，精密度不高，但是也符合ng/ml級RSD水平的一般應<15%的要求，其中有一孔濃度為4.55，與其它孔比較差異較大，可能是由于操作引起例如加樣不準。而3ng/ml,和1.5ng/ml的變異系數(shù)CV為3.5%，3.7%，符合顯示孔間重復性好，符合ng/ml級RSD水平的一般應<15%的要求，精密度高。</p><p>　　2.3.

23、2 板間精密度的驗證</p><p>　　從同一實驗室中獲取2組同樣的數(shù)據(jù)，做板間精密度的驗證。首先對同一實驗條件下不同實驗人員所獲得的數(shù)據(jù)是否可用于板間分析做驗證。</p><p>　　以HBsAg理論濃度為橫坐標，所測OD值為縱坐標作圖，繪制標準曲線觀察線性關系。</p><p>　　以上標準曲線結(jié)果顯示第二組數(shù)據(jù)的R2 =0.967，第三組數(shù)據(jù)R2 =0.9

24、91。第二組數(shù)據(jù)由于有一些孔與標準曲線偏離較大，但考慮到隨機抽樣與均數(shù)存在一定誤差，還是可以用于統(tǒng)計學分析。下表對3組數(shù)據(jù)做板間分析。</p><p>　　從表中3個組的數(shù)據(jù)比較可知，HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的RSD分別為9.10%，12.06%，滿足對ng/ml級水平的RSD一般應<15%的要求，精密度高。而HBsAg 1.5ng/ml的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級水平的RSD一

25、般應<15%的要求，顯示低濃度的孔間重復性差，精密度不是很高，故以下對HBsAg理論濃度為1.5ng/ml的三組數(shù)據(jù)做分析。</p><p>　　對HBsAg理論濃度為1.5ng/ml的準確性，精密度分析</p><p>　　從上表可知第一組數(shù)據(jù)和第三組數(shù)據(jù)準確性差，精密度高。而第二組數(shù)據(jù)準確性高，而精密度相對于第一組和第三組數(shù)據(jù)要好。綜上對于HBsAg理論濃度為1.5ng/ml的這

26、一低濃度梯度的板內(nèi)準確性和板間精密度相對于高濃度的線性要差一些。</p><p>　　2.4 檢測限（LOD）計算</p><p>　　LOD為取空白孔的OD值的均數(shù)加2倍標準差。</p><p>　　由上表可知，LOD為0.172。檢測限（LOD）表示分析方法檢測低濃度樣品的能力，也稱為方法的靈敏度，LOD通常為標準曲線上的最低濃度點，要求標準曲線上的最低濃度點應

27、>LOD，此標準曲線上最低濃度點為0.25，大于LOD（0.172），故此標準曲線線性好。</p><p><b>　　3. 討論</b></p><p>　　3.1 乙肝表面抗原定量分析的意義</p><p>　　乙肝表面抗原是乙肝兩對半的其中一項，乙肝兩對半定性檢測對乙肝疾病的診斷，病情監(jiān)測，療效觀察起到了一定的作用。但隨著臨床醫(yī)學的

28、發(fā)展，乙肝兩對半定性檢測已經(jīng)遠遠不能滿足臨床及患者的要求，特別是在療效觀察以及乙肝疫苗注射后抗體產(chǎn)生情況的觀察上有明顯的不足。隨著檢驗醫(yī)學的發(fā)展，乙肝兩對半定量測定成為可行，大大彌補了乙肝兩對半定性檢測的不足。而且乙肝兩對半定量檢測可與HBV DNA熒光測定相互補充，綜合評價患者病情與藥物療效，為低含量的慢性乙肝、病毒攜帶者提供了正確判斷病情的依據(jù)【2】。這在目前的臨床治療中應用十分廣泛。</p><p>　　

29、3.2 常用定量分析方法</p><p>　　此次實驗只是對一種試劑盒的可用性進行方法學驗證， 而目前常用的定量方法已有很多，如TRFIA，TRFIA法又稱解離增強鑭系熒光免疫分析，是近十年發(fā)展起來的一種微量分析方法。此技術集酶標記、同位素標記技術的優(yōu)點于一身，具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好，且測定范圍更寬，試劑盒貨架壽命長，操作簡便和非放射性等特點，成為最有潛力的一種標記免疫分析方法【3】。全自動酶免分析儀

30、目前也廣泛應有，自動化、標準化的操作手段使實驗達到了全過程控制和全過程標準化分析，大大提高了實驗的精密度【4】，使檢測結(jié)果更趨穩(wěn)定，從而保證了實驗結(jié)果的可靠性。</p><p><b>　　3.3 方法概述</b></p><p>　　目前普遍使用的HBsAg試劑盡管在制備時采用了高親和力的單克隆抗體，并且使包被抗體、酶標抗體的結(jié)合位點盡可能的遠。以避免競爭抑制，最大

31、程度地解決鉤狀效應（HOOK）的問題【5】。本次實驗是對實驗室的一種試劑盒，即福州藍圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進行方法學驗證，以判斷是否能用于臨床樣本分析。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗。往預先包被HBsAg捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本，標準品，HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物的催化下轉(zhuǎn)化為藍色，并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化為黃色。顏色的深淺和樣

32、品中得HBsaAg呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度OD值，計算樣品濃度。</p><p>　　應用試劑盒HBsAg標準品從濃度為8，4，2，1, 0.5 ，0.25ng/ml 6個濃度梯度做標準曲線，以6，3，1.5ng/ml 3個濃度梯度5復孔做質(zhì)控，進行準確度，精密度和檢測限等方法學驗證。選擇最低濃度為0.25ng/ml的原因是因為，絕大多數(shù)HBV感染者外周血中可出現(xiàn)HBsAg，含量在5ng/m

33、l ～600ug/ml之間，高者可達2000ug／ml以上【6】，滿足了現(xiàn)階段文獻報道的最低濃度值。</p><p>　　3.4 方法學驗證內(nèi)容</p><p>　　方法學驗證內(nèi)容一般包括標準曲線，準確度，精密度和檢測限。標準曲線亦稱校正曲線，系指生物樣品中所測定的樣品濃度與響應的相關性，通常用回歸分析方法所得的回歸方程來評件，此實驗所用了6個濃度點建立標準曲線。方法準確度指待測濃度與真實

34、濃度的接近值了，一般用相對回收率表示，限度要求在85%—115%的范圍內(nèi)。精密度則表示分析方法的可重復性，是對同一樣品每次測定結(jié)果的一致性，用標準偏差和相對標準偏差表示，可做板內(nèi)和板間的驗證，對于ug/ml級水平的相對標準偏差一般應<10%, ng/ml級水平的相對標準偏差一般應<15%。檢測限則表示分析低濃度樣品的能力，通常又稱為靈敏度。</p><p>　　3.5 結(jié)果分析及應用評價</p&

35、gt;<p>　　第一組數(shù)據(jù)標準曲線R2=0.9973，顯示具有良好的相關性，HBsAg 濃度為6ng/ml和3ng/ml 的回收率分別為為97.58%，符合113.07%，符合限度要求在85%—115%的范圍內(nèi)。但是HBsAg 濃度為.5ng/ml的回收率為80.56%，顯示此試劑盒對于低濃度樣品的檢測準確度差。在精密度方面，6，3，1.5ng/ml變異系數(shù)CV分別為12.73% ，3.69% ，3.50%，而HBsAg

36、 6ng/ml的5個復孔的變異系數(shù)CV值為12.73%，顯示孔間差異較大，精密度不高，但是也符合ng/ml級RSD水平的一般應<15%的要求，其中有一孔濃度為4.55，與其它孔比較差異較大，可能是由于操作引起例如加樣不準不屬于試劑盒的問題，故可以認為此試劑盒對于批內(nèi)高、低濃度樣品的檢測精密度還是可以的。在做3個組數(shù)據(jù)的批間的精密度分析時，發(fā)現(xiàn)6，3，1.5ng/ml變異系數(shù)CV分別9.10%，12.06%，16.78%，分布方式從

37、低到高，前2個濃度滿足對ng/ml級水平的RSD一般應<15%的要求。1.5ng/ml的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級水平的RSD一般應<15%的要</p><p>　　綜上分析，該試劑盒對于高濃度樣品的檢測具有良好的準確性和較高的精密度，而對于低濃度樣品（<1.5ng/ml）的檢測在準確性和精密度方面都低于高濃度樣品，不適合低濃度樣品的檢測。目前絕大多數(shù)HBV感染者外周血HBsAg濃

38、度很低，該試劑盒不能全面檢測出此類人群，故該試劑盒不能用于臨床標本的檢測。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　【1】魏來，陶其敏．努力規(guī)范肝臟疾病的免疫學診斷．中華檢驗雜志，2003，26：69—71</p><p>　　【2】劉曉梅，張世蘭．HBsAg陰性結(jié)果的慢性乙型肝炎患者病毒血癥水平與臨床的關系[J】．臨

39、床檢驗雜志，2004，22(5)：381-382．</p><p>　　【3】李輝霞，王德志，楊朋，乙肝兩對半定量檢測及臨床意義，醫(yī)學信息雜志2010，23（9）。</p><p>　　【4】 Weber B, Dengler T, Berger A .Evaluation of two new autom ated assays for hepatitis B virus surfac

40、e HBsAg detection IMMUIITE HBsAg_and IMMUlITE 2000 HBsAg[ J] ．J .Clin Microbiol,2003 ,41,(1 )；13 5—143 ．</p><p>　　【5】鄭懷競．臨床免疫學檢驗質(zhì)量保證[M]．北京：北京醫(yī)科大</p><p>　　學，中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1995，99．</p>&l

41、t;p>　　【6】王朝陽，段文強 ,乙肝兩對半陰陽性之臨床意義，中國社區(qū)醫(yī)師雜志，2007，26(1)：12-13. </p><p><b>　　致 謝</b></p><p>　　在論文完成之際，我首先向關心幫助和指導我的指導老師表示衷心的感謝并致以崇高的敬意！</p><p>　　在學校的學習生活即將結(jié)束，面對現(xiàn)在的收獲，我感到無

42、限欣慰。為此，我向熱心幫助過我的所有老師和同學表示由衷的感謝!在論文工作中，遇到了許許多多這樣那樣的問題，有的是專業(yè)上的問題，有的是論文格式上的問題，一直得到老師的親切關懷和悉心指導，使我的論文可以又快又好的完成，老師以其淵博的學識、嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度、求實的工作作風和他敏捷的思維給我留下了深刻的印象，我將終生難忘我的老師對我的親切關懷和悉心指導，再一次向他表示衷心的感謝，感謝他為學生營造的濃郁學術氛圍，以及學習、生活上的無私幫助! 值此論

43、文完成之際，謹向老師致以最崇高的謝意!</p><p>　　最后，衷心地感謝在百忙之中評閱論文和參加答辯的各位專家、教授!</p><p><b>　　附 錄</b></p><p>　　乙肝表面抗原是乙肝兩對半的其中一項，乙肝兩對半定性檢測對乙肝疾病的診斷，病情監(jiān)測，療效觀察起到了一定的作用。但隨著臨床醫(yī)學的發(fā)展，乙肝兩對半定性檢測已經(jīng)遠遠