學術干貨共聚焦顯微鏡中熒光團的共定位

1、學術干貨：共聚焦顯微鏡中熒光團的共定位學術干貨：共聚焦顯微鏡中熒光團的共定位在多標熒光樣品圖像中，因兩個或多個熒光團在顯微結構中距離很近，經(jīng)常會有發(fā)射信號疊加，這種效應就稱為共定位。目前，高特異性合成熒光團和經(jīng)典免疫熒光技術的應用、精密光切技術的應用、共聚焦和多光子顯微鏡提供的數(shù)字圖像處理技術等大大提高了生物樣品中共定位檢測的能力。圖1共定位在生物表述上是這樣定義的：兩個或多個不同的分子位于樣品上同一個物理位置。對顯微鏡中看到的組織切片

2、、單個細胞或亞細胞器官，共定位意味著不同的分子連接到同一個受體上；在數(shù)字圖像方面，這個術語指的是不同熒光分子發(fā)射的顏色分享圖像中的同一個像素。在共聚焦顯微鏡中，樣品被記錄成含有很多像元的多維陣列數(shù)字圖像，每個像元代表一個三維像素。像元的尺寸（或檢測單元）由物鏡的數(shù)值孔徑、照明波長以及共焦檢測針孔直徑等決定。因此，在一個樣品中兩個熒光探針的共定位，比如發(fā)綠光的AlexaFlu488，發(fā)橘紅色光的黃色熒光染料AlexaFlu555在峰波長處

3、顯示很明顯的分離，人眼也很容易能夠區(qū)分。然而，光譜疊加（灰色陰影區(qū)域）表明在AlexaFlu555的發(fā)射峰上很明顯有AlexaFlu488的發(fā)射光譜（用一條黑線標示，從發(fā)射峰到橫坐標）。當AlexaFlu488的熒光發(fā)射強度明顯比AlexaFlu555的熒光發(fā)射強時，熒光信號這么高程度的串色使得熒光探針的分離很難。很多因素都會導致這種情況發(fā)生，比如熒光團標的物濃度的巨大差異。因此，在共定位實驗中，這些探針的組合就應該避免，或只有當圖像在