高靈敏納米生物傳感體系構建及在環(huán)境檢測中的應用.pdf

1、隨著環(huán)境污染問題的日益突出，人們對污染物檢測和監(jiān)管提出了更高的要求，發(fā)展新的、靈敏、可靠的檢測方法具有十分重要的意義。本論文主要從降低檢測背景和增強檢測信號兩個方面對提高檢測方法的靈敏度進行了研究，基于不同的新型材料構建了一系列新的生物傳感方法，并將其應用于環(huán)境污染物、環(huán)境微生物等檢測。本論文包括的主要內容如下：
　?。?）以氧化石墨烯為反應平臺，提出了一種基于分子信標向 G-四鏈體構型轉換，繼而引發(fā)核酸雜交連鎖反應的高靈敏Pb2

2、+檢測方法。作者設計了兩段分子信標探針 H1和H2，H1的一端為富含鳥嘌呤（G）的序列，并且“莖”部分有一個堿基錯配。當不存在Pb2+時，由于石墨烯對探針單鏈部分具有強烈的吸附作用，H1和H2吸附在石墨烯表面。當 Pb2+存在時，H1分子信標被打開，富含 G堿基的一端與 Pb2+形成G-四鏈體結構，另一端暴露出來的單鏈序列啟動核酸雜交連鎖反應，不斷有分子信標被打開，最終形成超長的雙鏈結構。因為石墨烯對雙鏈DNA的吸附作用較小，雙鏈探針從

3、石墨烯表面脫離，熒光得到恢復。由于石墨烯超強的熒光猝滅效率以及核酸雜交連鎖反應的放大作用，該方法實現(xiàn)了對Pb2+的高靈敏檢測，最低檢出限為0.61 nM。另外，該方法操作簡單，選擇性好，靈敏度高，并且適用于實際水樣中Pb2+的檢測。（第2章）
　?。?）基于磁性Fe3O4和核酸雜交連鎖反應，通過構建一種超串聯(lián)探針信號放大模式，實現(xiàn)了對Hg2+的高靈敏檢測。該方法中應用了三段核酸探針：H1和H2的一端是富含胸腺嘧啶（T）的序列，H2

4、與 H3部分堿基互補配對。當待測體系中含有Hg2+時，H1和H2之間通過 T-Hg2+-T錯配形成雙鏈，進而引發(fā)核酸雜交連鎖反應，H2和H3的分子信標結構不斷被打開，形成超串聯(lián)核酸探針，從而達到放大熒光信號的目的。該方法的檢出限為0.36 nM，能夠滿足世界衛(wèi)生組織(WHO)對飲用水質監(jiān)測標準的要求（10 nM）。在本方法中，磁性Fe3O4作為反應平臺和分離介質，將檢測目標和信號探針從檢測介質中分離出來，有效地降低了其他離子的干擾，使得

5、該方法具有良好的選擇性，并且能成功地應用到實際樣品的檢測中。（第3章）
　?。?）利用磁性石墨烯對ssDNA的選擇性吸附能力和磁性分離能力，提出了一種先捕獲、富集，后檢測的Hg2+定量測定方法。該檢測體系包含 H1和H2兩段核酸探針。探針H1具有兩個功能，富含 T堿基的序列可以捕獲 Hg2+，其他序列可以通過吸附將整個探針固定在磁性石墨烯表面。當溶液中的Hg2+被 H1探針捕獲到磁性石墨烯表面，并且通過磁性分離和富集之后，加入釋放

6、序列H2，使得H1和H2形成完整的雙鏈結構，進而從石墨烯表面脫離，釋放出熒光。在最佳實驗條件下，經過5倍富集，該方法的最低檢出限為1.54 nM。該方法檢測范圍寬，靈敏度高，操作簡單，能夠較好地應用于環(huán)境水樣的檢測。（第4章）
　?。?）提出了一種基于納米金和核酸雜交連鎖反應的高靈敏比色方法用于檢測水體中的Hg2+。當反應體系中不含Hg2+時，H1、H2的單鏈部分吸附在納米金表面，使金納米粒子在高濃度鹽溶液中穩(wěn)定存在；而當 Hg2

7、+存在時，H1的分子信標結構能夠在Helper探針的輔助下被打開，繼而引發(fā)核酸雜交連鎖反應，使分子信標不斷被打開形成雙鏈結構。由于失去單鏈的保護作用，金納米粒子在高濃度鹽溶液中發(fā)生團聚，顏色由紅色變?yōu)樗{色。該方法操作簡單，只需將幾種試劑混合檢測即可，并且具有高靈敏度，高選擇性的優(yōu)點，適用于實際水體中Hg2+的檢測。（第5章）
　　（5）基于非標記納米金粒子的泄漏過程，提出了一種熒光能量共振轉移法，實現(xiàn)了環(huán)境水體中鹽酸的選擇性定量檢

8、測。納米金的最大吸收波長在520 nm左右，與熒光素的熒光發(fā)射波長一致，所以納米金通過熒光能量共振轉移能有效地猝滅熒光素的熒光。當存在鹽酸時，納米金的數(shù)量和表面形態(tài)發(fā)生改變，引起納米金吸光度降低，進而導致熒光強度升高。通過測定熒光強度，可以十分靈敏地實現(xiàn)鹽酸濃度的檢測。實驗表明，該方法在30 min內即可完成檢測，最低檢出限為0.6μM。由于金化學性質穩(wěn)定，其他離子的存在以及一般微小的環(huán)境變化對納米金的表面形態(tài)影響不大，所以該方法具有良

9、好的選擇性。（第6章）
　?。?）建立了一種基于銪配合物的時間分辨熒光傳感方法，實現(xiàn)了對水處理工藝中重要的功能菌——氨氧化細菌的定量檢測。銪配合物是一種長壽命發(fā)光材料，在時間分辨模式下可以有效降低生物基質的背景熒光，提高檢測方法的靈敏度。根據氨氧化細菌特異性序列，設計得到了兩段功能探針：末端修飾氨基的捕獲探針與目標序列的一部分堿基互補，并且通過戊二醛的交聯(lián)作用可以固定在氨基硅烷化的普通玻璃片表面；標記銪配合物的信號探針與目標 DN

10、A的另外一段堿基互補。當存在目標DNA時，捕獲探針和信號探針分別與目標DNA雜交，形成串聯(lián)結構，進而將信號探針固定在玻璃片表面。通過測定銪配合物的時間分辨熒光強度可以定量檢測目標 DNA和氨氧化細菌的數(shù)量。該方法靈敏度高，對常見大腸桿菌、多粘芽孢桿菌以及維氏硝化桿菌等細菌具有優(yōu)異的選擇性，并且能成功應用于實際污泥樣品的檢測。（第7章）
　　（7）基于長壽命量子點和葡萄糖氧化酶，建立了一種靈敏的非標記方法檢測血清中的葡萄糖。葡萄糖在

11、葡萄糖氧化酶的催化作用下產生的過氧化氫對量子點具有猝滅作用，因此量子點可以用于葡萄糖的定量檢測。但是由于過氧化氫對量子點熒光的猝滅效率不高，所以基于該原理的檢測方法靈敏度較低。通過向該檢測體系中引入對苯二胺，設計了一種更靈敏的葡萄糖檢測方法。對苯二胺在過氧化氫的氧化作用下產生的復雜化合物對量子點的熒光具有更高的猝滅效率，從而提高了檢測方法的靈敏度。另外，以長壽命量子點為熒光指示劑，在時間分辨熒光模式下能有效去除生物基質中的背景熒光，降低