高靈敏納米生物傳感體系構(gòu)建及在環(huán)境檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、隨著環(huán)境污染問(wèn)題的日益突出，人們對(duì)污染物檢測(cè)和監(jiān)管提出了更高的要求，發(fā)展新的、靈敏、可靠的檢測(cè)方法具有十分重要的意義。本論文主要從降低檢測(cè)背景和增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)兩個(gè)方面對(duì)提高檢測(cè)方法的靈敏度進(jìn)行了研究，基于不同的新型材料構(gòu)建了一系列新的生物傳感方法，并將其應(yīng)用于環(huán)境污染物、環(huán)境微生物等檢測(cè)。本論文包括的主要內(nèi)容如下：
　?。?）以氧化石墨烯為反應(yīng)平臺(tái)，提出了一種基于分子信標(biāo)向 G-四鏈體構(gòu)型轉(zhuǎn)換，繼而引發(fā)核酸雜交連鎖反應(yīng)的高靈敏Pb2

2、+檢測(cè)方法。作者設(shè)計(jì)了兩段分子信標(biāo)探針 H1和H2，H1的一端為富含鳥(niǎo)嘌呤（G）的序列，并且“莖”部分有一個(gè)堿基錯(cuò)配。當(dāng)不存在Pb2+時(shí)，由于石墨烯對(duì)探針單鏈部分具有強(qiáng)烈的吸附作用，H1和H2吸附在石墨烯表面。當(dāng) Pb2+存在時(shí)，H1分子信標(biāo)被打開(kāi)，富含 G堿基的一端與 Pb2+形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，另一端暴露出來(lái)的單鏈序列啟動(dòng)核酸雜交連鎖反應(yīng)，不斷有分子信標(biāo)被打開(kāi)，最終形成超長(zhǎng)的雙鏈結(jié)構(gòu)。因?yàn)槭?duì)雙鏈DNA的吸附作用較小，雙鏈探針從

3、石墨烯表面脫離，熒光得到恢復(fù)。由于石墨烯超強(qiáng)的熒光猝滅效率以及核酸雜交連鎖反應(yīng)的放大作用，該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)Pb2+的高靈敏檢測(cè)，最低檢出限為0.61 nM。另外，該方法操作簡(jiǎn)單，選擇性好，靈敏度高，并且適用于實(shí)際水樣中Pb2+的檢測(cè)。（第2章）
　　（2）基于磁性Fe3O4和核酸雜交連鎖反應(yīng)，通過(guò)構(gòu)建一種超串聯(lián)探針信號(hào)放大模式，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+的高靈敏檢測(cè)。該方法中應(yīng)用了三段核酸探針：H1和H2的一端是富含胸腺嘧啶（T）的序列，H2

4、與 H3部分堿基互補(bǔ)配對(duì)。當(dāng)待測(cè)體系中含有Hg2+時(shí)，H1和H2之間通過(guò) T-Hg2+-T錯(cuò)配形成雙鏈，進(jìn)而引發(fā)核酸雜交連鎖反應(yīng)，H2和H3的分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)不斷被打開(kāi)，形成超串聯(lián)核酸探針，從而達(dá)到放大熒光信號(hào)的目的。該方法的檢出限為0.36 nM，能夠滿足世界衛(wèi)生組織(WHO)對(duì)飲用水質(zhì)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的要求（10 nM）。在本方法中，磁性Fe3O4作為反應(yīng)平臺(tái)和分離介質(zhì)，將檢測(cè)目標(biāo)和信號(hào)探針從檢測(cè)介質(zhì)中分離出來(lái)，有效地降低了其他離子的干擾，使得

5、該方法具有良好的選擇性，并且能成功地應(yīng)用到實(shí)際樣品的檢測(cè)中。（第3章）
　?。?）利用磁性石墨烯對(duì)ssDNA的選擇性吸附能力和磁性分離能力，提出了一種先捕獲、富集，后檢測(cè)的Hg2+定量測(cè)定方法。該檢測(cè)體系包含 H1和H2兩段核酸探針。探針H1具有兩個(gè)功能，富含 T堿基的序列可以捕獲 Hg2+，其他序列可以通過(guò)吸附將整個(gè)探針固定在磁性石墨烯表面。當(dāng)溶液中的Hg2+被 H1探針捕獲到磁性石墨烯表面，并且通過(guò)磁性分離和富集之后，加入釋放

6、序列H2，使得H1和H2形成完整的雙鏈結(jié)構(gòu)，進(jìn)而從石墨烯表面脫離，釋放出熒光。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，經(jīng)過(guò)5倍富集，該方法的最低檢出限為1.54 nM。該方法檢測(cè)范圍寬，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，能夠較好地應(yīng)用于環(huán)境水樣的檢測(cè)。（第4章）
　　（4）提出了一種基于納米金和核酸雜交連鎖反應(yīng)的高靈敏比色方法用于檢測(cè)水體中的Hg2+。當(dāng)反應(yīng)體系中不含Hg2+時(shí)，H1、H2的單鏈部分吸附在納米金表面，使金納米粒子在高濃度鹽溶液中穩(wěn)定存在；而當(dāng) Hg2

7、+存在時(shí)，H1的分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)能夠在Helper探針的輔助下被打開(kāi)，繼而引發(fā)核酸雜交連鎖反應(yīng)，使分子信標(biāo)不斷被打開(kāi)形成雙鏈結(jié)構(gòu)。由于失去單鏈的保護(hù)作用，金納米粒子在高濃度鹽溶液中發(fā)生團(tuán)聚，顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色。該方法操作簡(jiǎn)單，只需將幾種試劑混合檢測(cè)即可，并且具有高靈敏度，高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，適用于實(shí)際水體中Hg2+的檢測(cè)。（第5章）
　　（5）基于非標(biāo)記納米金粒子的泄漏過(guò)程，提出了一種熒光能量共振轉(zhuǎn)移法，實(shí)現(xiàn)了環(huán)境水體中鹽酸的選擇性定量檢

8、測(cè)。納米金的最大吸收波長(zhǎng)在520 nm左右，與熒光素的熒光發(fā)射波長(zhǎng)一致，所以納米金通過(guò)熒光能量共振轉(zhuǎn)移能有效地猝滅熒光素的熒光。當(dāng)存在鹽酸時(shí)，納米金的數(shù)量和表面形態(tài)發(fā)生改變，引起納米金吸光度降低，進(jìn)而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度升高。通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度，可以十分靈敏地實(shí)現(xiàn)鹽酸濃度的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)表明，該方法在30 min內(nèi)即可完成檢測(cè)，最低檢出限為0.6μM。由于金化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，其他離子的存在以及一般微小的環(huán)境變化對(duì)納米金的表面形態(tài)影響不大，所以該方法具有良

9、好的選擇性。（第6章）
　?。?）建立了一種基于銪配合物的時(shí)間分辨熒光傳感方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)水處理工藝中重要的功能菌——氨氧化細(xì)菌的定量檢測(cè)。銪配合物是一種長(zhǎng)壽命發(fā)光材料，在時(shí)間分辨模式下可以有效降低生物基質(zhì)的背景熒光，提高檢測(cè)方法的靈敏度。根據(jù)氨氧化細(xì)菌特異性序列，設(shè)計(jì)得到了兩段功能探針：末端修飾氨基的捕獲探針與目標(biāo)序列的一部分堿基互補(bǔ)，并且通過(guò)戊二醛的交聯(lián)作用可以固定在氨基硅烷化的普通玻璃片表面；標(biāo)記銪配合物的信號(hào)探針與目標(biāo) DN

10、A的另外一段堿基互補(bǔ)。當(dāng)存在目標(biāo)DNA時(shí)，捕獲探針和信號(hào)探針?lè)謩e與目標(biāo)DNA雜交，形成串聯(lián)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而將信號(hào)探針固定在玻璃片表面。通過(guò)測(cè)定銪配合物的時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度可以定量檢測(cè)目標(biāo) DNA和氨氧化細(xì)菌的數(shù)量。該方法靈敏度高，對(duì)常見(jiàn)大腸桿菌、多粘芽孢桿菌以及維氏硝化桿菌等細(xì)菌具有優(yōu)異的選擇性，并且能成功應(yīng)用于實(shí)際污泥樣品的檢測(cè)。（第7章）
　　（7）基于長(zhǎng)壽命量子點(diǎn)和葡萄糖氧化酶，建立了一種靈敏的非標(biāo)記方法檢測(cè)血清中的葡萄糖。葡萄糖在

11、葡萄糖氧化酶的催化作用下產(chǎn)生的過(guò)氧化氫對(duì)量子點(diǎn)具有猝滅作用，因此量子點(diǎn)可以用于葡萄糖的定量檢測(cè)。但是由于過(guò)氧化氫對(duì)量子點(diǎn)熒光的猝滅效率不高，所以基于該原理的檢測(cè)方法靈敏度較低。通過(guò)向該檢測(cè)體系中引入對(duì)苯二胺，設(shè)計(jì)了一種更靈敏的葡萄糖檢測(cè)方法。對(duì)苯二胺在過(guò)氧化氫的氧化作用下產(chǎn)生的復(fù)雜化合物對(duì)量子點(diǎn)的熒光具有更高的猝滅效率，從而提高了檢測(cè)方法的靈敏度。另外，以長(zhǎng)壽命量子點(diǎn)為熒光指示劑，在時(shí)間分辨熒光模式下能有效去除生物基質(zhì)中的背景熒光，降低