新型傳感界面構(gòu)建及其在農(nóng)藥分子檢測(cè)和生物活性研究中的應(yīng)用.pdf

1、農(nóng)藥在為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供保障的同時(shí)其殘留物也對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康造成危害，這就對(duì)當(dāng)前農(nóng)藥研究提出了兩方面的研究課題：一方面，發(fā)展快速、可靠的農(nóng)藥分析檢測(cè)方法保障食品安全和品質(zhì)；另一方面，開(kāi)發(fā)高效、低毒、低殘留的農(nóng)藥新品種，從源頭上降低農(nóng)藥殘留帶來(lái)的副作用。將靶標(biāo)蛋白與底物結(jié)合的高選擇性和分子識(shí)別能力與電化學(xué)檢測(cè)的靈敏、快速等特點(diǎn)結(jié)合，成為研究高效、便捷的農(nóng)藥分析檢測(cè)新方法的發(fā)展趨勢(shì)。利用靶標(biāo)蛋白與底物的分子識(shí)別能力建立抑制劑離體生物活性分析方法

2、，同樣對(duì)實(shí)現(xiàn)新型農(nóng)藥候選化合物的初期篩選和先導(dǎo)結(jié)構(gòu)化合物驗(yàn)證具有重要意義。無(wú)論是農(nóng)殘檢測(cè)還是藥物篩選，界面構(gòu)建和生物大分子的固定是影響傳感分析信號(hào)靈敏度和穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。本文利用電化學(xué)和表面等離子體共振技術(shù)，以乙酰膽堿酯酶（ACHE）和D1蛋白酶（CtpA）為靶標(biāo)蛋白構(gòu)建了幾種生物兼容的界面，圍繞發(fā)展基于靶標(biāo)蛋白分子識(shí)別的農(nóng)藥分子檢測(cè)和生物活性研究新方法這一中心，開(kāi)展了以下幾個(gè)方面的工作： 1.多壁碳納米管-殼聚糖-乙酰膽堿

3、酯酶復(fù)合界面的構(gòu)建及其與底物的分子識(shí)別利用戊二醛作為交聯(lián)劑將AChE固定在殼聚糖與多壁碳納米管組成的復(fù)合界面上。殼聚糖作為載體固定酶，為AChE提供一個(gè)理想的微觀環(huán)境以保持酶的活性，碳納米管的引入能有效降低酶催化產(chǎn)物硫代膽堿在電極上的氧化電位。固載的AChE能快速靈敏的催化溶液中的底物氯化乙酰硫代膽堿（ATC1），定量檢測(cè)ATC1在2.0-20.0μM和20.0-400.0μM兩個(gè)濃度區(qū)間內(nèi)與電流響應(yīng)有良好線性關(guān)系，AChE的表觀米氏常

4、數(shù)為132μM。該方法重現(xiàn)性好、靈敏度高、響應(yīng)迅速、穩(wěn)定可靠，有望為酶抑制劑的檢測(cè)提供一個(gè)經(jīng)濟(jì)、便利的檢測(cè)方法。 2.構(gòu)建多壁碳納米管-交聯(lián)殼聚糖-乙酰膽堿酯酶復(fù)合界面用于殺蟲(chóng)劑檢測(cè)及生物活性分析以多壁碳納米管交聯(lián)殼聚糖復(fù)合膜固定AChE，采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合方法，分析溶液中的殺蟲(chóng)劑與ATC1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合表面固定的酶。電化學(xué)信號(hào)的降低與殺蟲(chóng)劑三唑磷的濃度在0.03-7.8μM和7.8-32.0μM濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性，并定性分析比較了西

5、維因、馬拉硫磷、樂(lè)果對(duì)AChE的抑制效果，建立了基于AChE抑制的農(nóng)藥藥效快速分析電化學(xué)方法。改變表面同載的靶標(biāo)酶蛋白，可用于其它酶底物或模擬底物水解產(chǎn)物具有電化學(xué)活性的酶抑制劑的活性比較。 3.銀納米粒子-生物素復(fù)合界面固定乙酰膽堿酯酶檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥 將自主合成的biotin-聚醚鏈-硫辛酸與11-巰基-1-十一醇混合組裝于金電極表面，以avidin作為橋接將biotin衍生化的乙酰膽堿酯酶（AChE）固定于表面，

6、銀納米通過(guò)與avidin之間的靜電引力結(jié)合，進(jìn)而形成銀納米粒子-avidin-AChE復(fù)合界面。以ATC1為底物，根據(jù)氧化峰電流的減少，檢測(cè)到樂(lè)果在0.05.10.0μM濃度范圍內(nèi)與酶抑制率呈線性關(guān)系，線性擬合的相關(guān)系數(shù)分別0.9983，檢測(cè)限為0.01μM。 4.金納米粒子標(biāo)記的氨基甲酸酯與乙酰膽堿酯酶相互作用的表面等離子體共振研究 AChE通過(guò)共價(jià)鍵固定在11-巰基-1-十一酸的自組裝膜上，將本課題組設(shè)計(jì)合成的

7、兩種抑制劑先導(dǎo)化合物（HY1和HY2）通過(guò)硫金鍵固定于金納米粒子表面實(shí)現(xiàn)標(biāo)記（記作ALC1和ALC2）。AChE與抑制劑之間的相互作用會(huì)引起表面等離子體（SPR）信號(hào)的變化，金納米特殊的光學(xué)性質(zhì)放大SPR檢測(cè)信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度，得到AChE與HY1、HY2的結(jié)合動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)：結(jié)合速率常數(shù)（Ka）分別為1.46×105（Ms）-1和7.73×104（Ms）-1，解離速率常數(shù)（Kd）分別為4.66×10-2s-1和1.21×10-1s-1，

8、計(jì)算得到親合常數(shù)（KA）分別為3.13×106和6.39×105M-1。此體系結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)模式可以實(shí)現(xiàn)其它小分子農(nóng)藥類(lèi)似物的免標(biāo)記活性比較分析。 5.芯片表面原位形成金納米粒子放大表面等離子體共振信號(hào)檢測(cè)酶抑制劑 固定反應(yīng)時(shí)間，SPR信號(hào)與AChE的活性有對(duì)應(yīng)關(guān)系，根據(jù)酶活性的抑制程度建立了有機(jī)磷農(nóng)藥三唑磷的高靈敏檢測(cè)方法，在0.5-14.0μM濃度范圍內(nèi)，三唑磷濃度與SPR信號(hào)呈線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.05μM。在這個(gè)體

9、系中，無(wú)論是酶、底物還是分析物都無(wú)需標(biāo)記和固定，反應(yīng)在溶液中進(jìn)行，為農(nóng)藥檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單、無(wú)標(biāo)記、實(shí)時(shí)、靈敏的檢測(cè)方法。 6.D1蛋白酶與二茂鐵標(biāo)記24肽相互作用的電化學(xué)檢測(cè)及抑制劑活性分析 利用一步沉積法將氯金酸還原成金納米原位沉積于電極表面構(gòu)成金納米-殼聚糖的復(fù)合界面固定CtpA。二茂鐵（Fc）標(biāo)記的24肽作為底物，通過(guò)與界面固定的CtpA相互作用結(jié)合到電極表面。結(jié)果表明，溶液中的Fc-24P在2.0-65.0

10、μM的濃度范圍內(nèi)與電流響應(yīng)呈現(xiàn)良好線性，通過(guò)測(cè)量小分子抑制劑與Fc-24P對(duì)D1蛋白酶的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，對(duì)三種CtpA抑制劑先導(dǎo)化合物HY1、HY2和NA1進(jìn)行了生物活性分析。 7.D1蛋白酶與金納米粒子標(biāo)記24肽相互作用動(dòng)力學(xué)的表面等離子體共振研究及其應(yīng)用 金片表面修飾生成羧基化葡聚糖界面后將羧基活化，利用酰胺鍵將CtpA固定在芯片上。利用SPR技術(shù)研究金納米標(biāo)記的24肽與表面固定的CtpA相互作用，得到動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)Ka=