鄰苯二甲酸二丁酯宮內(nèi)暴露下的多代雄性生殖毒性及睪丸DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的改變.pdf

1、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Environmental endocrine disruptors，EEDs)是一類能干擾機(jī)體天然激素合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)、結(jié)合或清除的各種外源性物質(zhì)。這類物質(zhì)可導(dǎo)致動(dòng)物和人類生殖功能障礙、生殖能力下降、幼體滅亡甚至滅絕等，其對(duì)人群健康的危害受到國內(nèi)外專家廣泛關(guān)注。眾多環(huán)境內(nèi)分泌干擾物中以鄰苯二甲酸酯類(phthalic acidesters，PAEs)污染最為嚴(yán)重，鄰苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthala

2、te，DBP)是其代表物之一。本室前期研究發(fā)現(xiàn)流經(jīng)重慶主城區(qū)的嘉陵江及長江水中，DBP檢出量最高可達(dá)9．48μg/L。而化學(xué)安全國際計(jì)劃(the International Program on Chemical Safety，IPCS)所估計(jì)的飲用水中。DBP暴露量小于1．0μg/L。 美國國家毒理學(xué)計(jì)劃(National Toxicology Program，NTP)的研究確認(rèn)DBP具有顯著的雄性生殖毒性及發(fā)育毒性。大量動(dòng)

3、物資料顯示，大鼠宮內(nèi)DBP暴露可致雄性子代睪丸萎縮、附睪畸形、隱睪癥和尿道下裂等病變。有研究發(fā)現(xiàn)，DBP暴露不僅影響F0代大鼠，還可影響F1代乃至F2代的生殖和發(fā)育。IPCS綜述了關(guān)于DBP致突變性的文獻(xiàn)后認(rèn)為DBP不具有遺傳毒性，因此損傷機(jī)制有可能來自于遺傳外機(jī)制。近年來，表觀遺傳學(xué)(epigenetics)已成為基因表達(dá)調(diào)控的研究熱點(diǎn)，它是指在基因的DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下，基因的功能發(fā)生了可遺傳的改變，并最終導(dǎo)致表型的變化。

4、DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要機(jī)制之一，在胚胎早期發(fā)育、組織特異性的基因表達(dá)和大部分基因沉默中起關(guān)鍵作用。DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的，目前發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有轉(zhuǎn)甲基活性的酶有Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的改變可導(dǎo)致基因組DNA甲基化的異常和表遺傳調(diào)節(jié)的紊亂。因此，我們推測(cè)DBP的雄性生殖毒性可能是通過影響DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。 目前關(guān)于DBP宮內(nèi)暴露對(duì)雄性仔鼠生殖系統(tǒng)影響的研究使用

5、的劑量都比較高，大多數(shù)都在500mg/kg以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了人類可能的最大攝入量(1131μg/kg)。而實(shí)際上環(huán)境和生物體內(nèi)所含的DBP濃度經(jīng)常是非常低的，所以研究低劑量下DBP的生物學(xué)效應(yīng)更有意義。本研究以未觀察有害效應(yīng)水平(NOAEL)50mg/kg為最低劑量對(duì)親代孕鼠進(jìn)行宮內(nèi)暴露，驗(yàn)證DBP對(duì)F1代雄性大鼠的生殖影響，觀察DBP對(duì)雄性的生殖損傷能否持續(xù)至F2代，并通過分析F1代和F2代睪丸DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)改變，探索DBP

6、對(duì)雄性生殖損傷是否通過表遺傳學(xué)機(jī)制起作用。 方法： 1．多代繁殖動(dòng)物模型： SPF級(jí)SD孕鼠72只，隨機(jī)分為五組，分別為玉米油(Corn oil)對(duì)照組(相對(duì)于DBP的溶劑對(duì)照)、DBP50mg/(kg·d)組(簡(jiǎn)稱DBP50)、DBP250mg/(kg·d)組(簡(jiǎn)稱DBP250)，每組各20只孕鼠，DMSO對(duì)照組(相對(duì)于Vinclozolin的溶劑對(duì)照)、Vinclozolin100mg/(kg·d)組

7、(簡(jiǎn)稱Vin100)每組各6只孕鼠。自妊娠第8天(GD8)至妊娠第21天(GD21)，按2ml/kg灌胃量每日對(duì)親代孕鼠經(jīng)口灌胃染毒。同劑量組不同窩別的F1代仔鼠于出生后第90天按雌雄比1:1交配產(chǎn)生F2代仔鼠。 2．觀察指標(biāo)： 1)F0代及F1代孕鼠：大鼠一般生長情況、體重增長情況、繁殖功能(雌鼠妊娠時(shí)間、產(chǎn)仔數(shù)、活仔數(shù)、仔鼠出生窩重、仔鼠出生平均體重、性別比率、哺育4天存活率)和臟器重量等。 2)F1代

8、及F2代雄性仔鼠：仔鼠一般生長情況、出生后4天肛殖距、臟器重量、睪丸及附睪病理組織學(xué)觀察、精子評(píng)價(jià)。 3)采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈擴(kuò)增(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)法檢測(cè)F1代及F2代雄性仔鼠睪丸組織中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA的表達(dá)。 3．統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料用方差分析

9、，數(shù)據(jù)用x±s的形式表示。P<0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果與討論： 1．DBP宮內(nèi)暴露多代繁殖動(dòng)物模型的建立 整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，大鼠飲食飲水狀況正常，生長情況良好，根據(jù)OECD實(shí)驗(yàn)指南和Skinner等的四代動(dòng)物模型建立DBP宮內(nèi)暴露多代繁殖動(dòng)物模型，所得結(jié)果與相關(guān)多代繁殖實(shí)驗(yàn)大體一致，說明成功建立了多代繁殖動(dòng)物模型。 與玉米油對(duì)照組相比，DBP50組F1代仔鼠的出生體重以及肝臟系數(shù)降低(P<

10、0．05)，刺激F1代孕鼠哺乳期體重增長(P<0．05)，這有可能是DBP低劑量的hormesis效應(yīng)；F2代腎臟系數(shù)增加(P<0．05)。 DBP250組，F(xiàn)0代孕鼠哺乳期體重降低，F(xiàn)1代仔鼠出生窩重以及PND21和PND28的體重降低(P<0．05)，說明DBP可影響F0代孕鼠的繁殖以及F1代仔鼠的生長。F1代雄性仔鼠心臟系數(shù)增加，F(xiàn)2代雄性仔鼠肝臟系數(shù)降低，睪丸臟器系數(shù)增加(P<0．05)。其余指標(biāo)各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

11、義(P>0．05)。 2．DBP宮內(nèi)暴露對(duì)F1及F2代雄性仔鼠生殖系統(tǒng)的影響 與玉米油對(duì)照相比，DBP50組F2代精子體、尾部畸形率增加(P<0．05)，但總畸形率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。DBP250組F1代雄性仔鼠肛殖距縮短(P<0．05)，精子數(shù)目明顯減少(P<0．01)，精子頭部、體部及總畸形率增加(P<0．05)以及睪丸曲細(xì)精管變性率增加；F2代雄性仔鼠精子頭部及總畸形率增加(P<0．05)。這說明

12、DBP對(duì)F1及F2代雄性仔鼠生殖均有損傷作用，對(duì)F2代的損傷僅觀察到精子畸形率的增加。 3．DBP宮內(nèi)暴露對(duì)F1及F2代雄性仔鼠睪丸DNA甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)的影響 F1代雄性仔鼠：與玉米油對(duì)照組相比，DBP各劑量組Dnmtl基因表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與DBP50組相比，DBP250組Dnmtl基因表達(dá)顯著升高(P<0．05)。與玉米油對(duì)照組相比，DBP50組和DBP250組Dnmt3b基因表達(dá)均降低(P<0．0

13、5)。與DMSO溶劑對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組Vin100的Dnmt1和Dnmt3b基因表達(dá)顯著降低(P<0．05)。 F2代雄性仔鼠：與玉米油對(duì)照組相比，DBP50組Dnmt3b基因表達(dá)降低(P<0．05)DBP250組Dnmt1基因表達(dá)升高，Dnmt3b基因表達(dá)降低(P<0．05)。與DMSO溶劑對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組Vin100的Dnmt1基因表達(dá)顯著增加(P<0．05)。 以上結(jié)果表明，DBP宮內(nèi)暴露對(duì)F1代及

14、F2代大鼠睪丸Dnmt1和Dnmt3b基因表達(dá)均有影響。 結(jié)論： 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)暴露DBP能干擾F0代孕鼠的生長與繁殖，引起F1代與F2代雄性仔鼠心、肝、腎、睪丸臟器系數(shù)的改變，是否毒性所致還需進(jìn)一步觀察。DBP對(duì)F1代雄性生殖系統(tǒng)損傷明顯，表現(xiàn)在肛殖距縮短、精子數(shù)目減少、精子畸形率增加以及睪丸曲細(xì)精管變性率增加，但F2代僅觀察到精子畸形率增加。DBP增加F1代與F2代雄性仔鼠睪丸組織Dnmt1的mRNA表達(dá)

15、，降低Dnmt3b的mRNA表達(dá)。結(jié)合Dnmts的mRNA表達(dá)情況和生殖系統(tǒng)出現(xiàn)的損傷結(jié)果，我們推測(cè)DBP有可能通過改變Dnmts的表達(dá)，導(dǎo)致某些基因的過表達(dá)或抑制，從而使雄性子代生殖系統(tǒng)受損。 創(chuàng)新性 1．本研究觀察了DBP親代宮內(nèi)暴露對(duì)SD大鼠三代生殖及發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)DBP對(duì)F1代雄性仔鼠生殖系統(tǒng)有明顯損傷，對(duì)F2代雄性仔鼠僅觀察到精子畸形率的改變。我們還發(fā)現(xiàn)DBP不僅損害雄性子代的生殖系統(tǒng)，還引起其他實(shí)質(zhì)性器

16、官的發(fā)育異常。 2．本研究在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到宮內(nèi)暴露于DBP可導(dǎo)致能延續(xù)至子二代的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的異常改變。 研究不足之處 由于時(shí)間的限制，我們的研究還有不完善的地方，比如Dnmts在蛋白質(zhì)水平上的驗(yàn)證工作，以及睪丸發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子序列的DNA甲基化改變等。 下一步計(jì)劃 下一步我們打算利用甲基敏感任意引物聚合酶鏈法對(duì)基因組DNA差異甲基化片段進(jìn)行篩選，旨在能篩選到高甲基化或低甲基