常用實驗方法和所需試劑的配制

1、（一）（一）Westernblot實驗實驗1.Westernblot主要實驗試劑主要實驗試劑溴酚藍（BromphenolBlue）麗春紅（PonceauS）考馬斯亮藍（CoomassiebrilliantblueR250）吐溫20（Tween20）β巰基乙醇(βMercaptoethanol)十二烷基硫酸鈉（SDS）過硫酸銨（APS）TEMED聚丙烯酰胺凝膠單體貯備溶液4濃縮膠緩沖液4濃縮膠緩沖液甘氨酸Tris堿脫脂奶粉牛血清白蛋白（B

2、SA）硝酸纖維素膜（NC膜）蛋白質Marker和預染Marker通用蛋白裂解提取試劑BCA法蛋白定量試劑盒Bradfd法蛋白定量試劑盒兔源性抗抗體辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgGECL超敏發(fā)光液定影液、顯影液、X光膠片曝光盒其他試劑（乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等）2.Westernblot主要實驗試劑的配制方法主要實驗試劑的配制方法（1）10%SDS溶液:SDS粉末1g加雙蒸水10mL使其溶解，室溫保存。②取0.5mL勻漿液移入新

3、的2mLEP管內，加1mL蛋白抽提試劑并混勻，靜置10min后（偶有顛倒混勻），12000g4℃離心10min。③棄去上清保留蛋白質膜，加2%SDS溶液500μL，100℃水浴10min，4℃放置2小時使蛋白質膜充分溶解。（2）總蛋白濃度的測定（）總蛋白濃度的測定（BCA法）法）①配制統一的蛋白質標準品：以牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)的標準品溶液（濃度為1mgmL）制作蛋白質標準曲線。分別吸取BSA標準品

4、溶液0、100、200、400、800、1200、1600和2000μL，各自加入0.01MPBS溶液補足到2000μL，配成梯度濃度的標準品溶液，分裝后20℃?zhèn)溆谩＂谂渲艬CA工作液：按50：1的比例將BCA試劑盒內的A試劑與B試劑進行混合，配成BCA工作液。室溫保存，1d內使用。③樣品處理：取各樣品10μL，加0.01MPBS溶液490μL，配成待測樣品。④加樣：先于酶標板上樣孔內加入200μLBCA工作液，再分別加入倍比稀釋的標準

5、品及待測樣品各20μL，酶標儀上震蕩3min，充分混勻。⑤測定：將酶標板置于恒溫水浴箱中，37℃孵育30min。用MRK3型酶標儀測定562nm波長下各孔吸光度值（opticaldensity，OD），采用Softmax5.2軟件計算各樣本蛋白質濃度。（3）樣品濃度的配平和制備）樣品濃度的配平和制備①配平：按測定的各樣品蛋白質濃度，用2%SDS溶液配平各樣品總蛋白濃度。根據預實驗結果，將組織的總蛋白濃度調為1mgmL。②制備：將配平后的

6、樣品與5上樣緩沖液按4：1的比例混合。100℃水浴10min，部分4℃保存用于電泳，部分20℃保存?zhèn)溆?。?）樣品內蛋白含量的檢測）樣品內蛋白含量的檢測①凝膠的配制：配制12%分離膠和5%濃縮膠（配制方法見附錄）。②上樣：分別用Eppendf微量移液器吸取蛋白質Marker或樣品各10μL，將槍尖的插入加樣孔的底部，緩慢地將樣品或Marker加入加樣孔，避免有氣泡產生。③電泳：濃縮膠：電壓100V、電流400mA，電泳20min；分離膠