第二章(1、2)植物組織培養(yǎng)實驗室的組成、儀器設備及基本操作

1、第二章 植物組織培養(yǎng)實驗室的組 成、儀器設備及基本操作,一、植物組織培養(yǎng)實驗室的結構及設計要求： 完整的植物組織培養(yǎng)室通常包括洗滌室、化學實驗室、接種室、培養(yǎng)室、細胞學實驗室等部分?？梢愿鶕?jù)實際需要和條件進行設計。 但從功能上至少包括準備室（化學實驗室）、接種室以及培養(yǎng)室三部分，并且按順序排列。 在化學實驗室與接種室之間應留有緩沖空間。,第一節(jié) 實驗室結構、儀器設備及操作技術,（一）準備室（化

2、學實驗室）： 1. 主要功能： 用于培養(yǎng)器皿的清洗、干燥、培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌、試管苗的出瓶及整理等工作。,2. 主要儀器設備及用品： 藥品柜、實驗臺、水槽、超聲波洗滌儀、涼干架、干燥箱、各種玻璃器皿（燒杯、量筒、容量瓶、試劑瓶、三角瓶等）、蒸餾水制造裝置。 天平、移液器、 pH計、水浴鍋、微波爐、電爐、磁力攪拌器、蠕動泵、及培養(yǎng)基分裝用品等、高壓滅菌鍋、 冰箱。,（二）接種室（無菌操作

3、室）： 1、功能： 接種材料的滅菌、接種以及培養(yǎng)物的繼代轉接等。 接種室要求保持潔凈，與化學實驗室之間應設置緩沖室。,,2、儀器設備及用品： 超凈工作臺、紫外燈、小推車、擱架、磁盤、接種工具（各種鑷子、解剖刀、手術剪、普通剪刀接種針、酒精燈、手持噴霧器、細菌過濾器等）等。,（三）培養(yǎng)室： 1、功能： 主要用于植物材料的培養(yǎng)。 要求室內潔凈并能保持一定的溫度、光照以及濕

4、度，以促進植物材料的生長和分化。,2、儀器設備及用品： 培養(yǎng)架及燈管、搖床（振蕩器）、空調、自動定時器、加濕及除濕器、光照培養(yǎng)箱等。,（四）細胞學實驗室： 1、功能： 主要用于培養(yǎng)材料的顯微觀察及照相等。,2、儀式設備及用品： 體視顯微鏡、普通顯微鏡、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、配套顯微照相裝置、普通相機或數(shù)碼相機、切片機及配套制片及染色用品等。,體視顯微鏡,,用途：放大倍數(shù)5~80倍主要用于植物形態(tài)

5、分化的觀察、莖尖的切取。,普通光學顯微鏡,用途：用于植物切片觀察，確定植物的發(fā)育進程，如：不定芽、不定胚的分化過程以及其它器官組織的分化等。,倒置顯微鏡,用途：主要用于細胞、原生質體的細胞分裂和細胞團形成的觀察。,（一）洗滌： 1. 普通器皿：采用洗衣粉、洗潔精等中性洗滌劑洗滌。 2. 難清洗器皿及移液管等：用水清洗后再用重鉻酸鉀洗液浸泡，最后清水沖洗，或用超聲波儀清洗。,重鉻酸鉀洗液的配制方法：43g重鉻酸鉀溶于100

6、0ml蒸餾水中，將濃硫酸緩慢倒入重鉻酸鉀溶液中，濃度比例為1：1。,二、實驗室基本操作：,1、器具滅菌：培養(yǎng)皿、解剖刀、鑷子等用品。 （1）干熱滅菌：鋁箔包好后，放于恒溫干燥箱內，150 ℃保溫2小時，成本較高。 （2）高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌鍋內120 ℃ 15－20分鐘 。 （3）灼燒滅菌：接種時，解剖刀及鑷子等浸入95％乙醇，然后取出在酒精燈火焰上灼燒殺菌。,（二）滅菌： 滅菌 是指用物理和化學方法殺死物

7、體表面和內部的所有微生物（包括芽胞），使之呈無菌狀態(tài)。經過滅菌的物品稱“無菌物品”。,,2、培養(yǎng)基滅菌： 采用高壓蒸汽滅菌。120℃ 15－20分鐘。 培養(yǎng)基體積越大，滅菌時間越長。,高溫高壓滅菌對培養(yǎng)基成分的影響：　a.pH值普遍下降?！.產生混濁或沉淀，這主要是由于一些離子發(fā)生化學反應而產生混濁或沉淀。例如Ca+2與PO4-3化合，就會產生磷酸鈣沉淀?！.不少培養(yǎng)基顏色加深。　d.體積和濃度有所變化。

8、　e.營養(yǎng)成分有時受到破壞。,3、不耐高溫材料的滅菌： 采用過濾滅菌，如IAA、ZT、天然有機添加物等。,4、外植體的表面滅菌： 采用70－75％乙醇（10-30秒）、有效氯1％的次氯酸鈉（5-30分鐘）、0.1－0.2%的氯化汞（2-15分鐘）等殺菌劑中加入幾滴吐溫－20或80（Tween－20或80）效果較好。,（三）無菌操作： 1、保持接種室的無污染環(huán)境，定期熏蒸或噴霧處理。接種前打開超凈工作臺及紫外燈照射2

9、0-30分鐘，關閉紫外等燈后使氣體散出后開始操作。 2、保持超凈工作臺的潔凈：接種前用70％乙醇擦拭臺面或用噴壺噴霧，操作前，將手和手臂用70％乙醇消毒，所需試驗用品用乙醇擦拭后放入超凈工作臺。,3、點燃酒精燈，進行操作，接種材料前后，灼燒瓶口，工具要灼燒徹底，防止交叉污染。4、保持培養(yǎng)室的潔凈，發(fā)現(xiàn)污染及時挑出，以減少污染源。5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽，出入接種室換拖鞋以保持接種室的潔凈。,第二章 植物組織培養(yǎng)實驗室的

10、組成、儀器設備及基本操作,第一節(jié) 實驗室結構、儀器設備及操作技術 一、植物組織培養(yǎng)實驗室的結構及設計要求 二、 實驗室基本操作,第二章 植物組織培養(yǎng)實驗室的組 成、儀器設備及基本操作,第二節(jié) 培養(yǎng)基的組成、配制與滅菌,一、培養(yǎng)基（medium）的組成和作用,通常植物組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基包括以下六大類成分，即礦質營養(yǎng)、有機成分、植物生長調節(jié)劑、碳源、瓊脂以及其他附加物等。,培養(yǎng)基的主要指標是:

11、 營養(yǎng)成分的濃度 植物生長調節(jié)物質的濃度,（一）礦質營養(yǎng)： 礦質營養(yǎng)又稱無機營養(yǎng)，是指植物生長發(fā)育所需要的各種化學元素。,礦質元素的生理作用：（1）組成各種化合物，成為結構物質；（2）許多酶和附酶的組成部分，參與代謝；（3）維持離子平衡、膠體穩(wěn)定及電荷平衡等電化學作用；（4）影響形態(tài)發(fā)生和組織、器官的建成等。,根據(jù)植物對元素的吸收量，可以把植物必需元素分為大量元素和微

12、量元素。 國際植物生理學會規(guī)定植物所需濃度大于0.5 mmol/l的的元素稱為大量元素。低于0.5 mmol/l的元素稱為微量元素。 大量元素：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 分別占植物干重的百分數(shù)為18％、10％、70％、0.3%、0.07％、0.3%、0.3 ％、0.07%、0.05％。 微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等。,1、大量元素： N、P、K、Ca、Mg、S等6種大量

13、元素依靠各種無機鹽提供。 不同植物種類和不同試驗目的對元素的使用量要求不同，需經試驗確定。 目前已選擇出多種培養(yǎng)基配方用于植物組織培養(yǎng)。其中以MS應用最廣泛。 以MS為例6中礦質元素分別由KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO47H2O、CaCl24H2O提供。,,大量元素中的氮通常采用硝態(tài)氮或銨態(tài)氮，但銨態(tài)氮濃度過高會對有些植物的培養(yǎng)物造成傷害，不適宜使用過高的濃度，可以用谷氨酸、絲氨酸等來代替。,2、微量元素

14、： 植物組織的對其需要量極少，過多會產生毒害，如造成蛋白質變性、酶失活,代謝障礙等。 各種微量元素均具有特定的生理功能，如硼與蛋白質的合成及糖類的運輸有關；銅能促進離體根的形成；錳參與植物的光合作用和呼吸作用；鉬為氮素代謝的重要元素。,微量元素中，鐵的用量較大，它對葉綠素的合成起重要作用，由于在較高pH下，F(xiàn)eCl3極易形成Fe（OH）3沉淀，難以被吸收，所以多用乙二胺四乙酸二鈉鹽與硫酸亞鐵形成的螯合物，并且單獨配制。,（二）有

15、機成分： 主要包括各種維生素和氨基酸 常用的維生素：硫胺素（VB1）、吡哆醇（VB6）、煙酸（VB3）、泛酸鈣（VB5）、生物素、鈷胺素（VB12）、葉酸等。 常用的氨基酸：甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。 有時添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，為牛乳經酶法加工的水解產物，含有20種氨基酸的混合物，用量10－1000mg/L, 通常用于原生質體等培養(yǎng)。 此外肌醇是另外一種重要

16、的有機成分，在維持離子平衡，糖類的轉化中起重要作用，此外還參與磷脂代謝及等生理作用。它可以促進愈傷組織的形成，不定芽、不定胚的分化。,（三）植物生長調節(jié)物質： 植物激素是植物代謝中產生的天然化合物，它能直接影響植物細胞的分化、分裂以及影響植物的形態(tài)建成、開花、結實、成熟、衰老脫落、休眠、萌發(fā)等生理活動。 在植物組織培養(yǎng)中，主要通過植物激素及生長調節(jié)物質對離體的組織、器官的形態(tài)發(fā)生進行調控。包括誘導細胞分裂、愈傷組織的生長、根

17、芽的分化以及體細胞胚胎發(fā)生等。,常用的植物激素及生長調節(jié)物涉及五大類植物激素：1、生長素類：2、細胞分裂類：3、赤霉素類：4、脫落酸：5、多胺6、乙烯：,1、生長素類： 組織培養(yǎng)中的功能是：促進細胞伸長生長和細胞分裂，誘導形成愈傷組織，促進生根。 常用的有NAA、IAA、IBA、2,4－D等。,2、細胞分裂素類： 功能：誘導芽的分化、促進側芽萌發(fā)；促進細胞分裂和擴大，促進莖增粗，抑制莖伸長；延緩衰老。 常用

18、細胞分裂素有BA、KT、ZT、2ip等。,此外近年來發(fā)現(xiàn)苯基脲衍生物具有非常高的細胞分裂素活性，在多種植物上應用。 如TDZ，CPPU，4－PU等。,3、赤霉素類： 主要具有誘導莖的細胞伸長，對根無效；對形成層細胞分化有影響，與生長素協(xié)同作用；可以誘導離體成花；打破休眠等功能。 常用GA3、GA4等。,4、脫落酸（ABA）： 促進休眠、衰老和脫落。組織培養(yǎng)中較少使用，主要用于種質資源的離體保存。,5、乙烯： 主要促

19、進衰老和脫落，高濃度易形態(tài)變化。,（四）碳源： 碳源主要為細胞提供合成新化合物的骨架，為細胞的呼吸代謝提供底物與能源，此外還能維持一定的滲透壓。 常用的碳源主要是蔗糖，使用濃度在10－50g/L，此外果糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物組織培養(yǎng)。,（五）瓊脂： 瓊脂作為固化劑用于組織培養(yǎng)中，起支持植物的作用，不提供營養(yǎng)，為海藻中提取的一種高分子化合物，僅溶于熱水（90 oC以上），成為凝膠，冷

20、卻后（40 oC以下）即凝固為凝膠。 瓊脂的用量通常在4～10g/L。,（六）有機附加物： 1、椰子汁： 用量為100～200g/L。 2、香蕉泥： 使用量為150～200g/L。 3、蘋果汁、番茄汁等。,（七）其他成分： 1、活性炭：使用量為0 .2-1%。 2、抗生素：常用青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5～20mg/L。 3、抑制酚類物質：抗壞血酸. 4、生長抑

21、制劑： 常用矮壯素、比久（B9）、多效唑（pp333） 、三碘苯甲酸、根皮酚等.,二、培養(yǎng)基的類型：1、高鹽濃度培養(yǎng)基：MS、B5、SH等。 適用于多數(shù)營養(yǎng)需求量較大的植物。2、低鹽培養(yǎng)基：WPM、 White、 Nitsh等。 適用于木本植物的培養(yǎng)。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,表3 N6培養(yǎng)基的組成和配方,三、培養(yǎng)基母液及激素母液的配制： 由于培養(yǎng)基中元素用量少，種類多，因此每

22、次稱量繁瑣，因此通常將各種營養(yǎng)成分配制成母液保存。 大量元素 微量元素 有機營養(yǎng) 激素,1、器皿和用具的準備 儀器包括萬分之一天平，百分之一天平，pH計 用品包括不同型號的燒杯（2000ml、1000ml、100ml），容量瓶（1000ml、500ml、100ml）、移液管（10ml、5ml、2ml、1ml）、試劑瓶若干（1000ml、250ml）、移液器（1

23、000ul、200ul）、滴管、玻璃棒、試管、各種規(guī)格三角瓶（150ml、100ml、50ml）、培養(yǎng)基分裝器，漏斗、稱量紙、標簽紙、不同范圍pH試紙、鉛筆等。 玻璃器皿用前清洗干凈。,2、藥品及蒸餾水準備： 藥品采用分析純或化學純試劑。 水利用蒸餾水或去離子水。,3、母液配制： （1）配制母液原則：,相同類型的試劑混合；易形成沉淀的藥品分開；母液濃度要適宜；用量要認真計算和核對； 藥品要準確稱量。,（2

24、）MS培養(yǎng)基母液的配制： MS培養(yǎng)基母液根據(jù)試劑特性通常配成四種母液，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（100或1000倍）、Fe鹽（100倍）、有機物（100倍）。 配置前先進行根據(jù)培養(yǎng)基組成和配制體積計算母液試劑用量，然后稱取藥品，大量元素可以用百分之一或千分之一天平，微量元素，鐵鹽和有機物用萬分之一天平稱量。,（3）激素母液的配制： 根據(jù)各種激素的使用濃度配制適宜的母液，用萬分之一天平稱取

25、激素，溶劑溶解后加水定容。 生長素類、赤霉素類及脫落酸等用95％乙醇溶解；細胞分裂素類用1N HCl或1N NaOH溶解。 通常激素母液濃度生長素類為0.1~0.5 mg/ml, 細胞分裂素母液濃度為0.2~1.0 mg/ml.,四、培養(yǎng)基的配制：,量取母液：營養(yǎng)元素和激素。稱量蔗糖、瓊脂，放入600ml左右蒸餾水的鍋內，電路上加熱，使瓊脂溶化。加入母液，混合均勻，調整pH值。,四、培養(yǎng)基的配制：,量取母液：

26、營養(yǎng)元素和激素。稱量蔗糖、瓊脂，放入600ml左右蒸餾水的鍋內，電路上加熱，使瓊脂溶化。加入母液，混合均勻，調整pH值。,封口：用4－6層稱量紙或瓶蓋封口，之后滅菌備用。分裝入瓶，每瓶40－50ml。,五、培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌）：1、加熱： 滅菌前檢查滅菌鍋內水量是否充足，然后將培養(yǎng)基放于滅菌鍋內，改好蓋，關閉放氣閥，打開電源，加熱升溫。2、排氣： 當溫度升至0.5kg/cm(100 0C)時，打開