2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素(fluesceinisothiocyanateFITC)FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體,其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4,最大吸收光波長為490~495nm,最大發(fā)射光波長為520~530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年,是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點是人眼對黃綠色較為敏感,通常切片標(biāo)本

2、中的綠色熒光少于紅色。FITC是一種常用的綠色熒光探針。FITC的吸收(激發(fā))和發(fā)射峰參見下表。FluopheAbsptionPeak(nm)EmissionPeak(nm)FITC492520當(dāng)FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應(yīng)時,主要是蛋白質(zhì)上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵(thiocarbe)結(jié)合,形成FITC蛋白質(zhì)結(jié)合物,即熒光抗體或熒光結(jié)合物。一個IgG分子中有86個賴氨酸殘基,一般最多能結(jié)合15~20個,一個IgG分子可結(jié)

3、合2~8個分子的FITC,其反應(yīng)式如下FITCN=C=SNH2蛋白質(zhì)→FITCNSCNH2蛋白質(zhì)常用Marsshall(1958)法標(biāo)記熒光抗體,也可以根據(jù)條件采用Chadwick等標(biāo)記法或Clark等(1963)的透析標(biāo)記法。1Marsshall法(1)材料抗體球蛋白溶液、05mol/L(pH90)碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1%硫柳汞水溶液、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH72或30的001m

4、ol/LPBS等。(2)方法及步驟①抗體的準(zhǔn)備取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中,再加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,使最后免疫球蛋白濃度為20mg/ml,碳酸鹽緩沖液容量為總量的1/10,混勻,將燒瓴置電磁攪拌器上(速度適當(dāng)以不起泡沫為宜)5~10min。②熒光素的準(zhǔn)備根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量,按每毫克免疫球蛋白加001mg熒光色素,用分析天平準(zhǔn)確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計算出免疫球蛋白、熒光素的量,還可以算出需加緩沖液的

5、量。a蛋白溶液:含量Amg/m1;容積Bml。b總蛋白量(AXB)=Crag。cC/20~C/10=Dmg(如蛋白含量低于20mg/ml,用C/10;如高于20mg/ml,用C/20)d熒光素FITC的量:(1/50~2/100)XC=Emg。e巳05mol/L(pH95)碳酸鹽緩沖液D/10=Fml。fPBS量D(BF)=Gml。注:A為蛋白含量,mg/ml;B為蛋白質(zhì)溶液的容積;C為蛋白總量,mg;D為常數(shù),mg;正為熒光素的量,m

6、g;F為碳酸鹽緩沖液的容積,ml;G為PBS的容積,ml。③結(jié)合(或標(biāo)記)邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,避免將熒光素粘于燒瓶壁(大約在5—10min內(nèi)加完),加完后,繼續(xù)避光攪拌12h左右。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。④透析結(jié)合完畢后,將標(biāo)記的球蛋白溶液離心(2500r/min)20rain,除去其中少量的沉淀物,裝入透析袋中,再置于燒杯中,用pH80緩沖鹽水透析(0~4~C)

7、過夜。⑤過柱取透析過夜的標(biāo)記物,通過葡聚糖凝膠SephadexG25或G—50柱,分離游離熒光素,收集標(biāo)記的熒光抗體進行鑒定。洗脫液:001mol/L磷酸鹽緩沖液(pH72);過濾量:12ml標(biāo)記全球蛋白液(過濾前未透析);收集量:20ml(稀釋17倍左右)。2Chadwick法(1)試劑和材料抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%碳酸鈉水溶液、001molLpH8.0PBS、1%硫柳汞、離心機及離心管、燒杯(25ml)攪拌器、無菌吸管,

8、無菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯(500ml)透析袋等。(2)方法及步驟①抗體準(zhǔn)備用o~4~C的pH8。0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30~40mg/ml,置入25ml燒杯內(nèi),放于冰槽中。②熒光色素準(zhǔn)備按每毫克免疫球蛋白加入熒光素001rug計算,稱取所需的熒光素,用3%碳酸鈉水溶液溶解。③將準(zhǔn)備的抗體與熒光色素溶液等量混合,充分?jǐn)噭?,在o~4~C冰箱中結(jié)合(最好在磁力攪拌機上持續(xù)攪拌)18~24h。④透析和柱層析方法同Marssha

9、ll法。3改良法(1)試劑和材料①001mol/L(pH72)PBS配法中,校定pH至72。NaCi18g、Na2HP04115g,溶于2000ml蒸餾水②05mol/L(pH90)碳酸鹽緩沖液配法取05mol/LNazCOs(53%)10ml加入05mol/LNaHC03(42%)90ml,混合后,校定pH至90。③3%碳酸鈉水溶液配法稱L5g無水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。④其他試劑和材料l%疊氮化鈉、離心機及離心管、

10、燒杯(25m1)、攪拌器、無菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯(500m1)透析袋等。(2)方法及步驟①取高效價的抗人球蛋白兔免疫血清,分離球蛋白,用鹽水(015mol/LNaCl)及緩沖液(05mol/LNaHC03—Na2C03,pH90)稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白質(zhì)lOmg,緩沖液為總量的10%,降溫至4℃。②加入異硫氰酸鹽(FITC)熒光素[蛋白:熒光素=(50—80)mg‘lmg],在0~4~C下電磁攪拌12~14h。③然后用半飽和的硫酸銨將標(biāo)

11、記球蛋白沉淀分離,除去未結(jié)合的熒光素,再用緩沖鹽水透析,除去硫酸銨(用Nessler試劑測驗,至隔夜透析的鹽水無氨離子及熒光色素為止)。④將制備好的熒光抗體加疊氮化鈉o01%,分裝在lml安瓿中,或凍干,保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上,一20~C保存可達(dá)2年以上。4透析標(biāo)記法此法適用于小量抗體的熒光素標(biāo)記,標(biāo)記簡便,非特異性染色較少。(1)試劑和材料試劑和材料同改良法。(2)方法及步驟①用0025mol/L碳酸鹽緩沖液pH90,將欲

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