中醫(yī)課題標(biāo)書(shū)

1、附件2省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目申請(qǐng)書(shū)2008yA006項(xiàng)目名稱(chēng)：溫補(bǔ)腎陽(yáng)法對(duì)哮喘小鼠骨髓CD34祖細(xì)胞分化的干預(yù)研究（此頁(yè)不可另行附頁(yè)）三、項(xiàng)目研究前景分析三、項(xiàng)目研究前景分析（包括國(guó)內(nèi)外同類(lèi)項(xiàng)目研究現(xiàn)狀，市場(chǎng)需求情況，研究開(kāi)發(fā)意義，可附主要參考文獻(xiàn)）支氣管哮喘(哮喘)是一種以嗜酸粒細(xì)胞(Eos)浸潤(rùn)為主的氣道反應(yīng)性炎癥和以氣道高反應(yīng)性(airwayhighreaction，AHR)為特征的疾病。當(dāng)今世界上約有1.6億哮喘病患者，發(fā)病率呈逐

2、年增長(zhǎng)趨勢(shì)。但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。目前認(rèn)為，氣道炎癥是哮喘AHR的基礎(chǔ)，而Eos是其關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞。Eos被激活后，能釋放EOS陽(yáng)離子蛋白(ECP)、主要堿基蛋白(MBP)、血小板活化因子(PAF)和白三烯(LTｓ)等，還能促使肥大細(xì)胞釋放組胺、5羥色胺、LT及趨化因子，并建立“自身維持環(huán)”(serfsustainingcycte)吸引更多EOS聚集到炎癥反應(yīng)部位—?dú)獾溃瑥亩纬梢环N周而復(fù)始的持續(xù)性(慢性)炎癥反應(yīng)，再釋放ECP、M

3、BP、PAF和緩激肽，這些細(xì)胞因子分布到氣道，對(duì)氣道黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性破壞作用，上皮成簇地脫落，將上皮細(xì)胞下的感覺(jué)神經(jīng)末梢C纖維暴露，從而形成氣道反應(yīng)性增高。近年來(lái)著眼于嗜酸粒細(xì)胞在哮喘氣道中的浸潤(rùn)和凋亡的研究較多，但關(guān)于哮喘骨髓嗜酸粒細(xì)胞分化的研究較少。Eos來(lái)源于骨髓CD34祖細(xì)胞。一般情況下，Eos祖細(xì)胞(EosB祖細(xì)胞)在骨髓分化成熟為Eos，后者在骨髓中存儲(chǔ)數(shù)日后被釋放至血循環(huán)，并在1h內(nèi)進(jìn)入組織[1]。哮喘患者體內(nèi)誘導(dǎo)CD

4、34細(xì)胞分化為Eos的刺激物增多，結(jié)果導(dǎo)致Eos從骨髓中釋放增多，隨后其在粘附分子等因子的作用下移出循環(huán)系統(tǒng)，并在其特異性的趨化物如Eotaxin等作用下向肺組織局部浸潤(rùn)。IL3、IL5、IFNγ等均可影響骨髓嗜酸粒細(xì)胞的分化、增殖及遷移。研究表明，變應(yīng)原吸入后5小時(shí)IL3應(yīng)答的嗜酸粒細(xì)胞祖細(xì)胞顯著增加，變應(yīng)原吸入后12～24小時(shí)IL5應(yīng)答的嗜酸粒細(xì)胞祖細(xì)胞顯著增加，變應(yīng)原吸入后48小時(shí)，骨髓IFNγ水平也顯著增加，說(shuō)明變應(yīng)原吸入后骨髓

5、多種細(xì)胞因子水平以時(shí)間依賴(lài)的變化方式調(diào)節(jié)和控制著骨髓嗜酸粒細(xì)胞祖細(xì)胞的分化、增殖及遷移活動(dòng)[2]。其中IL5是關(guān)鍵的嗜酸粒細(xì)胞生成因子。IL5能特異作用于嗜酸粒細(xì)胞，不僅可遠(yuǎn)距離地作用于骨髓嗜酸粒細(xì)胞祖細(xì)胞促進(jìn)其繁殖、分化，維持并延長(zhǎng)成熟嗜酸粒細(xì)胞的生存期，引起嗜酸粒細(xì)胞趨化和黏附[3]。GMCSF是刺激骨髓嗜酸粒細(xì)胞分化、增殖和抗嗜酸粒細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子[4]。此外，嗜酸細(xì)胞活化趨化因子Eotaxin也可在不依賴(lài)IL3、IL5、GMC

6、SF的情況下誘導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞從臍帶血CD34祖細(xì)胞的分化[5]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子5（STAT5）也具有明顯的促CD34嗜酸粒細(xì)胞分化、增殖作用[6]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)哮喘動(dòng)物骨髓CD34祖細(xì)胞表明IL5Rα及Eotaxin受體CCR3表達(dá)升高。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明：糖皮質(zhì)激素潑尼松、強(qiáng)的松可抑制哮喘小鼠骨髓內(nèi)CD34造血細(xì)胞的增殖分化及遷移至外周血。但哮喘治療需堅(jiān)持長(zhǎng)期應(yīng)用激素，對(duì)人體副作用大。目前，西醫(yī)尚無(wú)另外成藥抑制哮喘骨髓Eos分化。

7、因此，尋找一種代替激素能夠降低哮喘骨髓Eos生成并且毒副作用少的藥物，具有巨大的市場(chǎng)潛力。而祖國(guó)醫(yī)學(xué)治療哮喘有上千年的歷史，積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，其中溫補(bǔ)腎陽(yáng)法是治療緩解期哮喘的經(jīng)典治法之一，療效確切，毒副作用少?，F(xiàn)代醫(yī)家對(duì)腎陽(yáng)虛在哮喘發(fā)病中的作用也有深刻認(rèn)識(shí)?？滦聵騕7]認(rèn)為無(wú)論何時(shí)期，腎虛(尤其是腎陽(yáng)虛)是本病最根本的病理機(jī)制，并提出防治哮喘發(fā)作當(dāng)以補(bǔ)腎溫陽(yáng)納氣為要。沈自尹[8]在用以溫補(bǔ)腎陽(yáng)藥為主的溫陽(yáng)片治療哮喘的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)腎虛

8、為哮喘患者的基本體質(zhì)。倪偉等[9]通過(guò)對(duì)緩解期哮喘患者腎陽(yáng)虛與氣道炎癥的研究表明腎陽(yáng)虛是哮喘緩解期的主要病機(jī)。實(shí)驗(yàn)研究也表明，溫補(bǔ)腎陽(yáng)法能對(duì)抗哮喘氣道炎癥，改善氣道痙攣，調(diào)節(jié)有下丘腦垂體腎上腺（HPA）軸等作用。如：張煒等[10]研究發(fā)現(xiàn)喘可治(巴戟天、仙靈脾等)可降低患者Eos絕對(duì)計(jì)數(shù)、IgE水平，消除氣道炎癥。張惠勇等[11]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)喘可治(巴戟天、仙靈脾等)霧化吸人能通過(guò)影響IFNγ和IL4的含量來(lái)調(diào)節(jié)Th1／Th2細(xì)胞比例，

9、糾正免疫失衡，抑制氣道炎癥。許建華等[12]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎陽(yáng)(鹿角片、肉蓯蓉、巴戟天、鵝管石、熟附片、肉桂)可使哮喘大鼠β2受體mRNA明顯上升。還發(fā)現(xiàn)[13]補(bǔ)腎定喘湯（鹿角片、肉蓯蓉、巴戟天、鵝管石、熟地、山藥、山萸肉、茯苓、丹皮、澤瀉、熟附片、肉桂)能使肺組織過(guò)高的GR水平下降，可升高血漿促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇（CT)水平，興奮垂體一腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)。溫補(bǔ)腎陽(yáng)法能使哮喘患者外周血或肺泡灌洗液中Eos數(shù)目降低，但其降低Eo

10、s的機(jī)制尚未見(jiàn)有深入研究報(bào)道。Eos的產(chǎn)生，受骨髓微環(huán)境中的細(xì)胞、調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)。中醫(yī)理論認(rèn)為腎主骨生髓，故應(yīng)用相關(guān)中藥調(diào)控骨髓造血微環(huán)境，可能有減少哮喘時(shí)Eos生成的作用。本研究選用臨床應(yīng)用頗為有效的溫補(bǔ)腎陽(yáng)方（由生熟地各15g，菟絲子15g，補(bǔ)骨脂15g，仙靈脾20g，巴戟天15g等組成，以下簡(jiǎn)稱(chēng)補(bǔ)腎方）進(jìn)行研究，探討溫補(bǔ)腎陽(yáng)法對(duì)哮喘小鼠骨髓中Eos祖細(xì)胞向Eos分化及其調(diào)節(jié)因子的干預(yù)作用機(jī)制，具有較大理論意義，有助于臨床

11、選方用藥。1.GiembyczMALindsayMA.Pharmacologyoftheeosinophil.PharmacolRev199951:213340.2.DmanSCSehmiRGauvreauGMeta1.Kiicsofbonemarroweosinophilopoiesisassociatedcytokinesafterallergeninhalation.AmJRespirCritCareMed2004169(5):5

12、49550.3.江榮林沈華浩.IL5、Eotaxin與支氣管哮喘.國(guó)外醫(yī)學(xué)呼吸系統(tǒng)分冊(cè)200424(1):l820.4.ShenZJEsnaultSMalterJS.ThepeptidylprolylisomerasePin1regulatesthestabilityofgranulocytemicrophagecolonystimulatingfactmRNAinactivatedeosinophils.Natlmmunol，2005

13、6(12):l280l287.5.BouchaibLSoussiGAQutaybaHetal.TheCCR3ReceptIsInvolvedinEosinophilDifferentiationIsUpRegulatedbyTh2CytokinesinCD34progenitCells.TheJournalofImmunology2002169:537–547.6.BuitenhuisM.BaltusB.Singaltransducer

14、activatoftranion5a(STATSa)isrequiredfeosinophildifferentionofhumancdblood—derivedCD34cells.Blood2003101(1):134l42.7.柯新橋補(bǔ)腎防喘述要湖北中醫(yī)雜志，1997，19(6)：38.沈自尹中西醫(yī)結(jié)合防治支氣管哮喘的探討中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1995，15(7)：4269.倪偉，于素霞，王宏長(zhǎng)，等緩解期哮喘患者腎陽(yáng)虛與氣道炎癥關(guān)系的

15、研究：附175例病例分析中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，20017(6)：6010.張煒，畢小利溫補(bǔ)腎陽(yáng)法治療成人支氣管哮喘急性期20例遼寧中醫(yī)雜志2002，29(12)：72011.張惠勇，倪偉，張金福，等喘可治注射液霧化吸入對(duì)調(diào)節(jié)支氣管哮喘大鼠免疫失衡的實(shí)驗(yàn)研究上海醫(yī)學(xué)200326(12)：90412.許建華，吳敦序，方肇勤，等不同補(bǔ)腎法對(duì)哮喘大鼠肺組織p2腎上腺素能受體mRNA的影響上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，15(3)：3813.許建華

16、，范忠澤，吳敦序，等補(bǔ)腎定喘湯對(duì)哮喘大鼠肺組織糖皮質(zhì)激素受體及血漿皮質(zhì)酮、ACTH的影響中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2003，9(1)：27技術(shù)路線技術(shù)路線擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題1.哮喘小鼠模型的復(fù)制。2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓CD34造血祖細(xì)胞及CD34CCR3細(xì)胞比例。3.原位雜交結(jié)合免疫組化方法測(cè)定骨髓細(xì)胞IL5RαmRNA及CD34的表達(dá)。BALBc小鼠60只空白對(duì)照組模型組補(bǔ)腎方高劑量組陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松)NS致敏NS霧化O

17、VAAl(OH)3百日咳滅活桿菌致敏2%OVA霧化激發(fā)7天補(bǔ)腎方低劑量組補(bǔ)腎方中劑量組NS灌胃7天末次激發(fā)后甲醛固定HE染色肺組織Eos浸潤(rùn)情況抗凝血Eos計(jì)數(shù)原位雜交免疫組化離心、瑞氏姬姆薩染色；ELISA骨髓懸液Eos計(jì)數(shù)IL5、EotaxinCD34造血祖細(xì)胞CD34CCR3比例IL5RαmRNACD34表達(dá)流式細(xì)胞儀NS灌胃7天NS霧化7天NS灌胃7天OVA霧化7天灌胃7天OVA霧化7天灌胃7天OVA霧化7天灌胃7天OVA霧化7