流式配色及分析

1、流式配色分析及實驗設(shè)計,熒光素是具有熒光特性的染料只在特定波長激光照射后才發(fā)出自身熒光發(fā)出的熒光顏色（波長）也是固定的,什么是熒光素,關(guān)于流式抗體,流式細(xì)胞技術(shù)：在細(xì)胞分子水平上；通過單克隆抗體；對單個細(xì)胞或其他生物粒子；進(jìn)行多參數(shù)；快速的；定量分析。,光學(xué)系統(tǒng)：經(jīng)熒光染色的細(xì)胞在激光的照射下產(chǎn)生散射光和熒光信號，同時被前向光電二極管和一組光電倍增管（PMT）接收，熒光信號經(jīng)一系列雙色性反射鏡和帶通或長通濾光片的分離，形

2、成多個不同波長的熒光信號,,,,光源,液流通路,信號和數(shù)據(jù),光源,液流通路,液流系統(tǒng)：鞘液包繞著單行排列的細(xì)胞依次高速通過流動池，而激光聚焦于流動池中心的樣本流上，隨后經(jīng)檢測的樣本和鞘液流向廢液桶。,,前向角散射光信號,,,側(cè)向角散射光信號,,外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點圖（紅細(xì)胞溶解后）,,,,熒光信號,使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量,光學(xué)系統(tǒng)：濾光片,如何將一束混合的熒光區(qū)分開

3、來，分別進(jìn)行收集呢？濾光片置于熒光探測器前，限定其接收的熒光的波長范圍,,Longpass(LP) Shortpass(SP) Bandpass(BP),流式結(jié)果除了染色的每個熒光抗體的表達(dá)情況，還包含了細(xì)胞的大小和復(fù)雜程度的情況FSC：前向角散射光，值越大，細(xì)胞越大SSC：側(cè)向角散射光，值越大，細(xì)胞越復(fù)雜,雙參數(shù)散點圖,單參數(shù)直方圖,,,多色組合原則,強(qiáng)弱搭配避免補(bǔ)償減少偶聯(lián)染料避開自發(fā)熒

4、光,流式細(xì)胞術(shù)中常見的熒光抗體一覽,常見流式儀可用熒光抗體一覽,可以也僅可以最多選擇8個熒光抗體去標(biāo)記抗原；需要注意：同一通道不可以選2種熒光抗體，例如：AF488，BB515,FITC 不可以同時使用；,CD5,CD8,,,染料的亮度與抗原表達(dá)強(qiáng)度相匹配,,,三大類:Primary: 很好鑒定，容易區(qū)分陰陽性細(xì)胞群，陰陽性峰分得很開Examples: CD3, CD4, CD45Secondary: 很好鑒定，較高水平表

5、達(dá)，經(jīng)常連續(xù)性表達(dá)Examples: CD27, CD28, CD45RA, CD45ROTertiary: 低水平表達(dá)，激活性marker，或者表達(dá)區(qū)分不明顯Example: CD25,染料的亮度與抗原表達(dá)強(qiáng)度相匹配,,,,染料的亮度與抗原表達(dá)強(qiáng)度相匹配,強(qiáng)弱搭配：即弱表達(dá)的抗原搭配強(qiáng)熒光，強(qiáng)表達(dá)的抗原搭配弱熒光,熒光素的強(qiáng)弱：強(qiáng)4：APC, PE,PE-CY7 BV421弱4：Fitc percpcy5.5 a

6、pc-cy7 BV510,抗原的強(qiáng)弱：強(qiáng)的：CD3,CD4,CD8,CD45等弱的：大部分胞內(nèi)/核內(nèi)因子（IL系列，F(xiàn)oxp3等）； CD25,大部分CD大于100（CD127,CD133等）；,,,,染料的亮度與抗原表達(dá)強(qiáng)度相匹配,,,,染料的亮度與抗原表達(dá)強(qiáng)度相匹配,Panel1,,,,染料的亮度與抗原表達(dá)強(qiáng)度相匹配,Panel2,,,,染料的亮度與抗原表達(dá)強(qiáng)度相匹配,Panel1,,,,染料的亮度與抗原

7、表達(dá)強(qiáng)度相匹配,Panel2,避免補(bǔ)償,CD45-FITCDim CD4-PE,CD45 FITC 漏到 PE， CD4 PE 弱信號分不開,CD45- PerCPDim CD4-PE,CD45 PerCP 不漏到 PE ，弱 CD4 可以分開,,,,Uncompensated,Compensated,,data spread due to spillover,,,避免補(bǔ)償,1）采用多激光激發(fā)減少重疊,2）避免雙激發(fā)熒光染料,488

8、激發(fā)：fitc pe percpcy5.5 pe-cy7635激發(fā)：apc apc-cy7405激發(fā)：BV421 BV510,CD3/CD4/CD8 可選 fitc apc-cy7 BV510,減少Pe-cy5，Amcyan等熒光抗體的使用率；,0 hours,2 hours,22.5 hours,PE,CD8,CD3,PE-Cy5,PE-Cy7,樣本曝光時間,PerCP,,減少偶聯(lián)染料的使用率：,選擇更穩(wěn)定的偶聯(lián)染料：,,,自發(fā)

9、熒光多的選擇用635激發(fā)的染料,Perfect!,,多色組合原則,1、要用什么抗體？要用多少種抗體？最多8種 4+2+22、強(qiáng)弱搭配染料的亮度與抗原表達(dá)相匹配3、避免補(bǔ)償不同激光器激發(fā)/ 避免雙激發(fā)染料4、減少偶聯(lián)染料使用更穩(wěn)定的偶聯(lián)染料5、自發(fā)熒光高的樣本：紅激光激發(fā),優(yōu)寧維流式免費課堂,流式實驗上機(jī)前的準(zhǔn)備,CD19,CD4,CD56,CD14,CD16,CD8,CD(Cluster of Differentiat

10、ion) marker:用于鑒定白細(xì)胞的分類，不同的白細(xì)胞表面帶有不同的CDmarker,通過帶有熒光標(biāo)記的抗體和抗原特異性結(jié)合：,CD19,CD4,CD56,CD14,CD16,CD8,流式鑒定白細(xì)胞的各種亞型：,表面蛋白流式檢測步驟：,,,Stain,Analyze,,Wash*2,檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子:,胞內(nèi)因子流式檢測步驟：,,,Fix,Permeabilize,Stain,Analyze,表面染色和胞內(nèi)染色的區(qū)別？,,,,,,,

11、CD4,IFN-r,Th1細(xì)胞,,CD4,IFN-r,,,,,,,正常染色情況下，由于抗體無法穿過完整的細(xì)胞膜，胞內(nèi)因子無法被染上顏色，僅表面marker染色成功；,通過固定破膜建立胞內(nèi)染色通道,,,,,,,IFN-r,Th1細(xì)胞,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,表面染色,固定破膜,胞內(nèi)染色,固定劑和破膜劑,固定劑：起穩(wěn)定細(xì)胞膜、保持細(xì)胞膜表面抗體與抗原結(jié)合的作用；,破膜劑：使流動的、完整的細(xì)胞膜產(chǎn)生小

12、孔以利于抗體進(jìn)入細(xì)胞；（少量沉淀正常，皂角苷沉降）,破膜的位置不同，破膜劑的選擇不同：,,,,,,,,,,,對于核內(nèi)/轉(zhuǎn)錄因子的檢測，我們需要采用針對破核的破膜劑；,固定劑和破膜劑,This kit enables the fixation and permeabilization of cells which is necessary for staining intracellular cytokines with fluoroc

13、hrome-conjugated anti-cytokine antibodies.,The BD Pharmingen? Transcription Factor Buffer Set is optimized for fixing and permeabilizing cells prior to immunofluorescent staining and flow cytometric analysis of cells tha

14、t express specific intracytoplasmic and intranuclear proteins.,胞內(nèi)因子和核內(nèi)因子的同時檢測：,問：同時檢測Th1/Th2/Th17和Treg這幾個細(xì)胞時是否有推薦的 buffer？,答：核內(nèi)因子和胞內(nèi)因子共測時一般推薦使用BD:562574轉(zhuǎn)錄/核內(nèi)因子固定破膜試劑盒；但是：經(jīng)驗證，F(xiàn)oxP3 與 IL-4無法同時檢測 ，但 FoxP3和IL-17a、 IFN-γ一起

15、染色良好。故當(dāng)需要同時檢測th2/Treg時需要準(zhǔn)備2種固定破膜試劑盒并分開檢測。,胞內(nèi)因子的含量與檢測效果,為何同時檢測Treg和Th，Th的陽性率很低而Treg正常？,胞內(nèi)因子的含量與檢測效果,為何同時檢測Treg和Th，Th的陽性率很低而Treg正常？,僅活化狀態(tài)下的T細(xì)胞才會特異性的分泌相關(guān)分泌型細(xì)胞因子，而正常情況下大部分T細(xì)胞處于未活化狀態(tài)； Foxp3本身屬于轉(zhuǎn)錄因子，始終存在于Treg細(xì)胞之中；,如想要

16、鑒定到th中的細(xì)胞因子，則必須對其進(jìn)行“開源”與“節(jié)流”。,胞內(nèi)因子的含量與檢測效果,如想要鑒定到th中的細(xì)胞因子，則必須對其進(jìn)行“開源”與“節(jié)流”。,開源：刺激活化T細(xì)胞。方法有二：1:PMA（PHA/LPS...)＋I(xiàn)onomycin:PMA能自由透過細(xì)胞膜，因此能繞過細(xì)胞膜受體直接激活PKC;Ionomycin則能使細(xì)胞膜外Ca2+進(jìn)入膜內(nèi)增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度升高；只有PMA+Ionomycin聯(lián)合應(yīng)用才是使T細(xì)胞

17、進(jìn)入細(xì)胞周期的最有效的方法.2.CD3/CD28：通過包被CD3和添加游離的CD28來封閉抗原提呈，從而一定程度上可以促進(jìn)T細(xì)胞增殖；但是效果不如PMA+離子霉素，并且對于某些T細(xì)胞亞型的活化效果也不好；,胞內(nèi)因子的含量與檢測效果,如想要鑒定到th中的細(xì)胞因子，則必須對其進(jìn)行“開源”與“節(jié)流”。,節(jié)流：阻斷細(xì)胞內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)運：1:Monensin：莫能霉素是一種離子載體(ionophore)，可以破壞高爾基體，抑制細(xì)胞內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)

18、運；2.BFA:全稱Brefeldin A（布雷霉素），是一種常用的蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑，特異性地可逆地阻斷蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)轉(zhuǎn)運到高爾基體(Golgi),,,胞內(nèi)因子的含量與檢測效果,The Leukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlug? is a ready -to-use polyclonal cell activation mixture containing the ph

19、orbol ester, PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate), a calcium ionophore (Ionomycin) and the protein transport inhibitor BD GolgiPlug? (Brefeldin A).,胞內(nèi)因子的含量與檢測效果,經(jīng)過“開源”和“節(jié)流”之后的樣本和先前的實驗結(jié)果對比：,未刺激活化,刺激活化后,,,,,流式實驗上機(jī)模版設(shè)置和結(jié)果分

20、析,流式實驗上機(jī)模版設(shè)置,,設(shè)置上機(jī)模版需要用到：空白對照管：去除自發(fā)熒光同型對照管：去除非特異性熒光單陽補(bǔ)償管：去除熒光泄漏實驗樣本管：檢測樣本,,一、空白對照管：即只有樣本的對照管；用來排除細(xì)胞的自發(fā)熒光，調(diào)節(jié)閾值、電壓，設(shè)定陰性區(qū)域；,,同型對照（Isotype Control）：使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的 背景染

21、色。,二、同型對照管：即樣本+同型對照抗體孵育的實驗管；用來排除細(xì)胞和抗體FC段非特異性結(jié)合產(chǎn)生的熒光,,非特異熒光產(chǎn)生原因分兩類，一類是抗體Fc段與細(xì)胞表面的Fc受體非特異結(jié)合上的熒光染料受光照發(fā)出的熒光，可使用FCR阻斷劑阻斷；另細(xì)胞損傷也會導(dǎo)致非特異性染色，此類染色無法阻斷，需用同型對照對比或進(jìn)行死細(xì)胞排除。例如：,針對紅細(xì)胞的抗體,,當(dāng)使用FCr阻斷劑進(jìn)行阻斷后同型對照依舊有較強(qiáng)雜信號和非特性干擾時，可用PI,7-aa

22、d,FVS等染料進(jìn)行死活細(xì)胞染色排除干擾；,,選擇BD Fixable Viability Stain Reagents（FVS染料）：,FVS染色不會被固定，破膜以及洗滌步驟影響；FVS的光譜多樣，適合多種染色組合的搭配，發(fā)射波普也非常集中；,,選擇BD Fixable Viability Stain Reagents（FVS染料）：,熒光補(bǔ)償：所謂“補(bǔ)償”就是除去某一熒光素誤入到其它熒光通道中的發(fā)射光信號。通過調(diào)節(jié)儀器完成這一

23、步驟。往往我們通過檢測帶有單一熒光素的樣本來減除誤入其他熒光通道的信號。既單陽管。,三、單陽管：帶有單一熒光抗體的樣本管用來排除熒光補(bǔ)償,**注意，實驗用到幾種熒光，就要制備幾種單陽管**,完整的流式實驗方案,,完整的流式實驗方案包括：空白對照管：去除自發(fā)熒光同型對照管：去除非特異性熒光單陽補(bǔ)償管：去除熒光泄漏實驗樣本管：檢測樣本,陰性對照與陽性對照,通過設(shè)置陰性對照和陽性對照更好的界定實驗組的樣本表達(dá)情況；,流式上機(jī)

24、時的儀器條件設(shè)置,閾值設(shè)定光電倍增管電壓設(shè)定補(bǔ)償調(diào)節(jié)門與設(shè)門,閾值設(shè)定,流式細(xì)胞分析的對象主要是細(xì)胞和微球，但實際上細(xì)胞碎片，顆粒性雜質(zhì)也會被檢測到。通過設(shè)定閾值可以減少后者的干擾；每個通道閾值都可以設(shè)定。通常選擇FSC通道進(jìn)行閾值的設(shè)定，特定情況下會同時/或設(shè)定其他通道的閾值；,,,通常使用空白對照調(diào)整閾值；,電壓設(shè)定,每一個流式通道都有自己特定的光電倍增管，其電壓獨立調(diào)控，在初次上機(jī)時一定都要調(diào)節(jié)到位，例如行fitc/pe

25、雙染，需調(diào)節(jié)fsc，ssc，fitc，pe4個通道的各自電壓；,通常使用空白對照進(jìn)行設(shè)定,電壓偏低,電壓合適,電壓偏高,在行多色實驗時，電壓應(yīng)該盡可能的合適甚至是稍微偏低，否則會影響到補(bǔ)償調(diào)節(jié)；電壓必須先于補(bǔ)償調(diào)節(jié)，改變電壓補(bǔ)償亦會隨之改變；,補(bǔ)償設(shè)定,通常使用單陽管進(jìn)行設(shè)定,光譜重疊會導(dǎo)致不同熒光通道間干擾，通過補(bǔ)償調(diào)節(jié)將干擾信號減去，從而保證流式分析結(jié)果的正確；調(diào)節(jié)補(bǔ)償是按照“被減原則”進(jìn)行；,,,Relative Inten

26、sity,650 nm,700 nm,,,500 nm,550 nm,600 nm,,,,,,,W,a,v,e,l,e,n,g,t,h,,(,n,m,),Detector - % Signal,FITC Compensation,,FL1,530/30,FL2,585/42,,FITC Compensation,24.8% of the SignalSensed in FL2,,,,650 nm,700 nm,,,500 nm,550

27、 nm,600 nm,,,,,Relative Intensity,,,W,a,v,e,l,e,n,g,t,h,,(,n,m,),,F,i,g,u,r,e,,C,,FL1,530/30,FL2,585/42,,,,650 nm,700 nm,,,,500 nm,600 nm,,,,,,Relative Intensity,W,a,v,e,l,e,n,g,t,h,,(,n,m,),550 nm,PE Compensation,,,FL3,

28、650 and Higher,FL1,530/30,FL2,585/42,,,同一樣本，調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償前后的變化：,當(dāng)實驗樣本珍貴/表達(dá)低時，可以選擇補(bǔ)償調(diào)節(jié)微球代理樣本進(jìn)行儀器調(diào)節(jié)：,BD CompBeads系列：,本身不攜帶熒光的微球，與熒光抗體特異性結(jié)合來調(diào)節(jié)補(bǔ)償可以用于胞內(nèi)/核內(nèi)染色，一起被固定破膜；可以用于多色分析和復(fù)合熒光素補(bǔ)償調(diào)節(jié)；靈敏度高，和抗原保持一致性好；,門與設(shè)門,什么是門？,在細(xì)胞分布圖中圈取/界定某一個范圍

29、或某一細(xì)胞性狀的細(xì)胞群，從而進(jìn)一步對其進(jìn)行單/多參數(shù)分析。門的形狀可以是任意形狀（線性，X形，象限）,門與設(shè)門,對于細(xì)胞群復(fù)雜，不易區(qū)分的情況下，有時候我們可以使用反向設(shè)門；,多色實驗中通常會進(jìn)行組合設(shè)門，將不同參數(shù)進(jìn)行結(jié)合，最終通過層疊邏輯性設(shè)門得出想要分析的相關(guān)參數(shù)：,特邀專家：BD IS部門 資深工程師 曾令武老師BD PMG部門 資深工程師 郝晉 博士BD PMG部門 高級工程師 馬紅 博士優(yōu)寧維 PMG