派森諾回饋新老客戶(hù)助力國(guó)家自然科學(xué)基金撰寫(xiě)

1、派森諾回饋新老客戶(hù)：助力國(guó)家自然科學(xué)基金撰寫(xiě) ——致正在撰寫(xiě)國(guó)家自然科學(xué)基金的各位老師的一封信 尊敬的各位老師，大家好！ 很多老師最近在致力于 2017 年國(guó)家自然科學(xué)基金的申報(bào)工作。 如果您申報(bào)的項(xiàng)目涉及到高通量測(cè)序技術(shù)， 在申報(bào)書(shū)中的“擬采取的研究方案及可行性分析”部分需要將研究方法、技術(shù)路線(xiàn)、實(shí)驗(yàn)手段、關(guān)鍵技術(shù)等內(nèi)容進(jìn)行說(shuō)明。如您并非專(zhuān)門(mén)從事高通量測(cè)序研究，可能會(huì)對(duì)這些內(nèi)容產(chǎn)生困惑。下面，我們派森諾生物就將最可能涉及到的幾種高通量

2、測(cè)序產(chǎn)品的采集提取、建庫(kù)測(cè)序和信息分析等內(nèi)容進(jìn)行說(shuō)明，為您在國(guó)家自然科學(xué)基金的撰寫(xiě)過(guò)程中提供參考。 1 微生物組測(cè)序 1.1 研究方案 1.1.1 樣品采集 微生物組測(cè)序樣品采集要求如下： 樣品類(lèi)型 樣品要求 土壤類(lèi) 取樣后低溫凍存，建議干冰運(yùn)輸，總量提供 1.5g 左右，如微生物含量少，可以適當(dāng)增加送樣量，并備注說(shuō)明，但總量不超過(guò) 10g。 排泄物類(lèi) 取樣后低溫凍存，建議干冰運(yùn)輸，總量提供 0.6g 左右，液體樣本約 600ul

3、左右，如微生物含量少，可以適當(dāng)增加送樣量，并備注說(shuō)明，但總量不超過(guò) 10g。 水樣類(lèi) 取樣后低溫凍存，建議干冰運(yùn)輸，未過(guò)濾提供 500ml 左右，已過(guò)濾好的提供過(guò)濾相應(yīng)體積水的濾膜，如微生物含量少，可以適當(dāng)增加送樣量。 核酸類(lèi) 總量>500ng，濃度>10ng/ul，DNA 有明顯主條帶，無(wú)明顯 RNA、蛋白修復(fù)帶有突出末端的 DNA 片段。 2） 3’端引入“A”堿基：在修復(fù)平整的 DNA 片段 3’端引入單堿基“A”

4、。而在接頭的3’末端含有單堿基“T”， 從而保證 DNA 片斷和接頭能夠通過(guò)“A”“T”互補(bǔ)配對(duì)連接，并防止接頭連接 DNA 片段的過(guò)程中，DNA 插入片斷彼此相連。 3） 連接接頭：在連接酶的作用下，孵育含有標(biāo)簽的接頭與 DNA 片段，使其相連。 4）富集 DNA 片段： 利用 PCR 選擇性地富集兩端連有接頭的 DNA 片段， 同時(shí)擴(kuò)增 DNA 文庫(kù)。PCR 應(yīng)盡量使用較少的循環(huán)數(shù)，避免 PCR 擴(kuò)增中文庫(kù)出現(xiàn)錯(cuò)誤。 5） 驗(yàn)證文庫(kù)

5、：利用 Pico green 和熒光分光光度計(jì)（Quantifluor-ST fluorometer, Promega, E6090; Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit, Invitrogen, P7589）方法定量文庫(kù)； 并使用安捷倫 （Agilent）2100 （Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent, 2100; Agilent High Sensitivity D

6、NA Kit, Agilent, 5067-4626）對(duì) PCR 富集片段進(jìn)行質(zhì)量控制，驗(yàn)證DNA 文庫(kù)的片段大小及分布。 6）均一化并混合文庫(kù)： 多樣品 DNA 文庫(kù) （Multiplexed DNA libraries） 均一化至 10nM 后等體積混合。 7） 上機(jī)測(cè)序：將混合好的文庫(kù)（10 nM）逐步稀釋定量至 4-5 pM 后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。 （3）原始數(shù)據(jù)整理、過(guò)濾及質(zhì)量評(píng)估 以 Illumina MiSeq 平臺(tái)測(cè)序?yàn)槔?

7、先進(jìn)行原始雙端序列的過(guò)濾和連接： 測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)以雙端（Paired-end） FASTQ 格式保存（R1.fastq 和 R2.fastq，Read1 和 Read2 序列一一對(duì)應(yīng)） ， 并采用以下步驟進(jìn)行過(guò)濾：首先， 采用滑動(dòng)窗口法對(duì)雙端的 FASTQ 序列做質(zhì)量過(guò)濾：窗口大小為 10 bp，步長(zhǎng)為 1 bp，從第一個(gè)堿基位置開(kāi)始移動(dòng)，要求窗口中堿基平均質(zhì)量 ≥ Q20（即堿基準(zhǔn)確率 ≥ 99%） ， 從第一個(gè)低于 Q20