遺傳改造的釀酒酵母分析技術(shù)平臺(tái)的建立及其在萜類生物合成途徑上各代謝物分析中的應(yīng)用.pdf

1、萜類化合物廣泛分布于植物及微生物初級(jí)代謝物和次生代謝物中，其種類繁多，不僅在植物的生命活動(dòng)中扮演重要的作用，而且還被廣泛的應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等方面，如倍半萜中的青蒿素、雙萜中的紫杉醇可分別作為抗瘧、抗癌的有效藥物。但是萜類在生物體內(nèi)的產(chǎn)量很低，而且分離和純化操作復(fù)雜。由于萜類結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)合成需要的步驟煩瑣，非常困難。由于酵母自身存在甲羥戊酸(Mevalonate，即MVA)途徑，可自我合成萜類前體，為利用代謝工程改造細(xì)胞代謝途徑為提

2、高萜類產(chǎn)量提供了一個(gè)很好的操作平臺(tái)，然而酵母中萜類前體庫(kù)不足夠提供高產(chǎn)，有必要調(diào)節(jié)其參與萜類前體生物合成的代謝途徑以提高產(chǎn)量。 本研究中，我們選擇釀酒酵母作為宿主細(xì)胞，以釀酒酵母中的萜類生物合成途徑為主要研究對(duì)象，建立遺傳改造的釀酒酵母的分析技術(shù)平臺(tái)，將最先進(jìn)的分析技術(shù)用于測(cè)量代謝物及其在一定條件下含量的變化，有助于闡釋遺傳干預(yù)對(duì)感興趣的途徑的影響，同時(shí)對(duì)微生物的應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行整體性無(wú)偏的描述，以進(jìn)一步理解通過(guò)這個(gè)途徑的代謝流的控

3、制分子機(jī)制，得到如下結(jié)果： (1)首次將基因敲除的分子生物學(xué)方法，引入釀酒酵母的次生代謝途徑萜類生物合成途徑中，以調(diào)節(jié)其代謝，增加其萜類前體庫(kù)供給。釀酒酵母中的萜類生物合成途徑主要分成六異戊二烯基焦磷酸合成途徑以及麥角甾醇生物合成途徑兩個(gè)部分。為了增強(qiáng)通往萜類前體的代謝流，構(gòu)建敲除盒，將負(fù)責(zé)FPP轉(zhuǎn)為角鯊烯，競(jìng)爭(zhēng)FPP的erg9基因，位于萜類前體下游的coql基因分別敲除，減少旁路消耗。用 (2)PCR方法構(gòu)建敲除盒Lo

4、xP-kanMX/URA3-loxP，分別敲除erg9基因和coql基因，剔除篩選標(biāo)記ura3后，分別得到新菌型BY4743-△erg9和BY4743-△ coql。在BY4743-△erg9基礎(chǔ)上，再利用敲除盒LoxP-URA3-loxP，敲除coql，基因，經(jīng)PCR驗(yàn)證，并剔除篩選標(biāo)記ura3，得到新菌型BY4743-△ erg9-△ coql。同時(shí)考察其基礎(chǔ)時(shí)間生長(zhǎng)曲線的變化，為下一步的基因．生理機(jī)能機(jī)制深入研究，提供基礎(chǔ)。野生菌

5、株生長(zhǎng)最快，缺失株生長(zhǎng)較慢，雙缺失菌生長(zhǎng)最慢，形成的菌落也較小。 (3)為了考察上述遺傳改造對(duì)萜類前體積累的效果，測(cè)定釀酒酵母的萜類生物合成途徑上重要的指標(biāo)性成分GGPP(二萜成分的前體)，分析它的變化，表征其隨erg9，coql基因缺失的關(guān)聯(lián)性，為闡明釀酒酵母中萜類合成途徑的調(diào)節(jié)分子機(jī)制提供現(xiàn)實(shí)依據(jù)。本研究首次建立LC-MS方法測(cè)定遺傳改造后釀酒酵母中GGPP含量的變化。應(yīng)用4.6 mm×25 cm SB-Aq C185-μm

6、(Agilent Tech．，USA)色譜柱進(jìn)行液相分離，流動(dòng)相75％(10mM三丁胺水溶液用15mM醋酸調(diào)成pH4.95)：25％甲醇，質(zhì)譜負(fù)離子模式掃描質(zhì)荷比范圍50-600，選擇離子檢測(cè)GGPP([M-H]-)，質(zhì)荷比449.2。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍0.1-50ng/ml。在這個(gè)范圍內(nèi)的，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10％，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜14％，精密度范圍96.5-105.4％。結(jié)果顯示，遺傳改造有效，BY4743-△erg9-A coql

7、的積累量在72小時(shí)后增加非常顯著。遺傳改造后的菌株與野生型菌株比較，含量有顯著差異(P＜0.01)；隨時(shí)間的長(zhǎng)短，含量顯著增高。說(shuō)明erg9與coql對(duì)GGPP的代謝顯著影響。 (4)為了研究遺傳改造對(duì)萜類生物合成途徑代謝流的影響，建立GC-MS方法測(cè)定萜類生物合成途徑上各代謝物及其在釀酒酵母中的應(yīng)用。本研究首次建立一個(gè)精確靈敏的非放射性的方法，同時(shí)定量釀酒酵母中萜類合成途徑上的GPP，F(xiàn)PP，GGPP，角鯊烯，麥角甾醇和羊毛甾

8、醇，考察代謝流的變化。這個(gè)方法建立在GPP，F(xiàn)PP和GGPP去磷酸化成相應(yīng)的烯萜醇，用GC-SIM-MS分析。本研究考察了三種轉(zhuǎn)化方法：酸解法、堿解法、酶解法。酸解法和堿解法的轉(zhuǎn)化率都低于15％，不能應(yīng)用于此，酶解法在不同的緩沖體系中的轉(zhuǎn)化率相差很大，50mM Bis-Trispropane/HCl，1mM MgCl2，pH7.0，轉(zhuǎn)化率＜1％；0.1M2-amino-2-methylpropanol/NaOH1mM MgCl2，pH1

9、0.35，轉(zhuǎn)化率＜1％；50 mM Tris-HCl，10 mMMgCl2，pn9.0，轉(zhuǎn)化率＜1％；0.1 M glycine/1 M NaCl/40％MeOH，pH10.4，轉(zhuǎn)化率＜2％，1 M diethanolamine，0.5 mM MgCl2，pH9.8，轉(zhuǎn)化率可＞88％，符合研究的需要。本研究綜合比較全發(fā)酵液提取法、細(xì)胞液離子交換柱提取法、細(xì)胞液超聲提取法三種提取方法，正己烷、石油醚、乙酸乙酯、氯仿：乙酸乙酯(1：10)四

10、種提取溶劑，0.5min、1.5min、3min這樣3個(gè)渦旋時(shí)間，比較其效率，確定最終的前處理方法為：細(xì)胞液超聲提取法，正己烷提取，渦旋3min。應(yīng)用TRACETR-5MS柱(30m×0.25mm×0.25μm)進(jìn)行氣相分離，單重四極桿質(zhì)譜選擇離子監(jiān)測(cè)GOH，F(xiàn)OH，GGOH，角鯊烯，麥角甾醇和羊毛甾醇，以保留時(shí)間和碎片信息進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果顯示，方法準(zhǔn)確有效，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，日內(nèi)和日間精密度良好，加樣回收率準(zhǔn)確度高。將此方法應(yīng)用

11、于釀酒酵母中，發(fā)現(xiàn)不同基因?qū)τ卺劸平湍钢休祁惡铣赏緩缴系母鱾€(gè)代謝物的代謝過(guò)程的作用是不一樣的，雙缺失erg9和coql，使得GPP、FPP、GGPP大量積累，而角鯊烯、麥角甾醇、羊毛甾醇的含量可維持細(xì)胞正常生理功能。 (5)通過(guò)考察不同遺傳改造的釀酒酵母基礎(chǔ)時(shí)間生長(zhǎng)曲線的變化，發(fā)現(xiàn)其生理活動(dòng)發(fā)生了變化。為了考察遺傳改造對(duì)細(xì)胞生理活動(dòng)的影響，建立熒光分析和化學(xué)發(fā)光方法測(cè)定分子操作后，與細(xì)胞生理特性和基因功能相關(guān)代謝物及其含量的變化

12、，有助于闡明萜類代謝途徑的基因敲除后，對(duì)細(xì)胞功能的影響。利用羅丹明6G，測(cè)得BY4743-△ erg9-△ coql離子外排作用低于野生型和單缺失菌，并且釀酒酵母的外排作用是能量依賴型的。利用JC-1，測(cè)得erg9與coql對(duì)線粒體膜電位的影響巨大，兩者的缺失打破線粒體膜電位分布的平衡，但24h后，不同遺傳改造的釀酒酵母建立的新的膜電位平衡無(wú)明顯差別。利用DCFA-DA，測(cè)得erg9與coql的缺失引發(fā)大量?jī)?nèi)源性活性氧的產(chǎn)生。利用熒光素

13、酶的化學(xué)發(fā)光，測(cè)得BY4743-△erg9-△ coqlATP的含量低于野生型和單敲除菌。 當(dāng)前的工作力求將代謝工程，化學(xué)分析，數(shù)據(jù)處理等多個(gè)領(lǐng)域結(jié)合，在細(xì)胞水平分析代謝物的變化以詳細(xì)地認(rèn)識(shí)基因一代謝產(chǎn)物、基因一代謝流之間關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制，分析生理狀態(tài)的變化以認(rèn)識(shí)基因功能。本研究涉及多種技術(shù)的聯(lián)用。這些方法包括分子生物學(xué)技術(shù)，微生物代謝活性瞬時(shí)淬滅，化合物的酶法衍生化、相關(guān)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的提取，色譜與質(zhì)譜的偶聯(lián)(GC-MS，LC-M