產(chǎn)脂肪酶微生物的篩選及其在多糖水解中的應(yīng)用.pdf

1、脂肪酶(EC3.1.1.3)即三酰甘油?；饷?，是一種酯鍵水解酶，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油單酯或甘油及游離脂肪酸。目前已發(fā)現(xiàn)多種具有不同酶學(xué)性質(zhì)和底物特異性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、轉(zhuǎn)酯及酯類手性合成等反應(yīng)中已表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。脂肪酶具有來源廣泛，分離純化簡(jiǎn)單和成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，將其作為非專一性水解酶應(yīng)用于幾丁質(zhì)的水解，將極大的降低酶法制備幾丁寡糖的成本。
　　本文通過富集培養(yǎng)、初篩培養(yǎng)和復(fù)篩培養(yǎng)從

2、土壤中獲得6個(gè)具有明顯脂肪酶活性的菌株，對(duì)酶活最高的一株進(jìn)行26s rDNA ITS區(qū)擴(kuò)增并測(cè)序，通過與NCBI中保存的數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性分析來進(jìn)行菌種鑒定，同時(shí)構(gòu)建菌株的進(jìn)化樹。經(jīng)鑒定此菌株屬于Rhizopus屬中的Stolonifer種，中文名稱為匍枝根霉。
　　為獲得最高的脂肪酶產(chǎn)量，在搖瓶培養(yǎng)條件下，利用響應(yīng)面法，對(duì)匍枝根霉發(fā)酵的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后，可溶性淀粉7.60 g/L，酵母膏22.59 g/L，K2H

3、PO45.55 g/L，NH4Cl1.80 g/L，MgSO4·7H2O2.40 g/L，NaCl1.00 g/L，橄欖油25.00 mL/L，吐溫-808.00mL/L，pH4.59，此時(shí)酶活達(dá)到最高，為1.40 U/mL，與發(fā)酵優(yōu)化前(0.46U/mL)相比，酶活提高了204.35％。
　　發(fā)酵液經(jīng)過離心、60％硫酸銨沉淀、透析、粗酶液濃縮、正己烷萃取、DEAE-Sepharose陰離子交換后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化后

4、脂肪酶達(dá)到電泳純，回收率為21.5％，純化倍數(shù)為32，分子量約為35KD，酶活為5760U/g。以PNPP為底物，酶促反應(yīng)的Km和Vmax分別為0.77mmol/L和5.39μmol/L·min。
　　將豬胰脂肪酶、假絲酵母脂肪酶、NOVO435脂肪酶、擴(kuò)展青霉脂肪酶和純化后脂肪酶同時(shí)應(yīng)用于幾丁質(zhì)的水解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬胰脂肪酶水解效果最明顯，對(duì)其水解幾丁質(zhì)的條件進(jìn)行研究，通過考察酶量、底物濃度、溫度、pH和反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)豬胰脂肪酶水