高效液相色譜熒光檢測流速梯度法測定去卵巢小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)張雷pdf

1、2005 年 1 月 色 譜 Vol .23 No.1January 2005 Chinese Journal of Chromatography 76 ～ 78高效液相色譜 高效液相色譜-熒光檢測流速梯度法測定 熒光檢測流速梯度法測定去卵巢小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì) 去卵巢小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)張 雷, 盧英俊, 鄧同樂, 鄭筱祥(浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系, 浙江杭州 310027)摘要 摘要:建立了同時(shí)檢測去卵巢(OVX)小鼠腦內(nèi)的

2、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、 5-羥色胺(5-HT)3 種神經(jīng)遞質(zhì)的高效液相色譜方法。 采用的色譜條件為:C1 8柱分離, 熒光檢測器檢測, 流動相為 0.1 mol/L 的 KH2 PO4 緩沖液-甲醇(體積比為 9 1), 設(shè)置單泵流速梯度洗脫。 方法的檢測限(S/ N =3)均在 10 nmol/ L 以下, 絕對回收率均在 80 % 以上 , 樣品日內(nèi)測定峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在 3.03%以下。該方法具有檢測靈敏度高、

3、樣品制備簡便等優(yōu)點(diǎn), 對小鼠腦內(nèi)的 3 種單胺類遞質(zhì)的檢測具有實(shí)用價(jià)值。關(guān)鍵詞 關(guān)鍵詞:高效液相色譜;流速梯度;去甲腎上腺素;多巴胺;5-羥色胺;去卵巢小鼠中圖分類號 中圖分類號:O658 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號 文章編號:1000-8713(2005)01-0076-03Measurement of Monoamine Transmitters in the Brains of Ovariectomized Mice

4、Using High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detectionand Gradient Flow Rate ElutionZHANG Lei, LU Yingjun, DENG Tongle , ZHENG Xiaoxiang(Department of Biomedical Engineering of Zhejiang University , Ha

5、ngzhou 310027 , China)Abstract :A method for the determination of norepinephrine (NE), dopamine (DA)and 5-hydrox-ytryptamine (5-HT)in brains of ovariectomized mice was established by using high performance liquid chromat

6、ograph with a fluorescence detector , a C18 column and a gradient flow rate delivered by a single pump.The mobile phase was a mixture of 0.1 mol/L KH2PO4 and CH3OH (9/1 ,v/v). Detection limits of the method were determin

7、ed to be lower than 10 nmol/L , absolute recoveries were above 80 %and the relative standard deviations (RSDs)of intra-day were all within 3.03 %. The method has the advantages of high sensitivity and of simple sample pr

8、eparation .Short analysis time and better separation of samples were also obtained.Key words :high performance liquid chromatography ;gradient flow rate;norepinephrine; dopamine ;5-hydroxytryptamine;ovariectomized mice單胺

9、類神經(jīng)遞質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與腦缺血、鎮(zhèn)痛、學(xué)習(xí)記憶等多種生理過程 ,具有重要的生理意義。該類神經(jīng)遞質(zhì)包括兒茶酚胺和吲哚胺等 ,前者主要指去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA), 后者主要指 5-羥色胺(5-HT)[1] 。國內(nèi)關(guān)于 NE ,DA 和5-HT 3 種神經(jīng)遞質(zhì)的檢測多采用高效液相色譜-電化學(xué)分析法(HPLC-ECD)[2 ～ 6] , 但由于 ECD 對流動相變化較為敏感, 故較少采用梯度洗脫。梯度洗脫中以流動相的濃度變化最

10、為常見 ,而以流動相的流速梯度的應(yīng)用在文獻(xiàn)中少有報(bào)道。本文采用高效液相色譜-熒光檢測法 ,嘗試設(shè)置單泵流速梯度洗脫,同時(shí)檢測了 NE ,DA 和 5-HT ,樣品的洗脫時(shí)間得到明顯縮短。1 材料和方法 材料和方法1 .1 儀器和試劑 儀器和試劑島津 LC-10Atvp 系列:RF-10AXL 熒光檢測器, LC-10Atvp 高壓泵, Rheodyne 7725 進(jìn)樣閥 。Her-aeus 公司 Labofuge 400R 冷凍離心機(jī)

11、。DA , 5-HT ,NE 和磷酸二氫鉀(KH2PO4)均為 Sigma 公司產(chǎn)品;收稿日期 收稿日期:2004-02-04第 1 期 張 雷等 :高效液相色譜法-熒光檢測流速梯度法測定去卵巢小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì) · 77 ·甲醇為國產(chǎn) HPLC 色譜純 , 高氯酸和鹽酸為國產(chǎn)分析純。1 .2 標(biāo)準(zhǔn)品和腦勻漿樣品的制備 標(biāo)準(zhǔn)品和腦勻漿樣品的制備準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品 NE 4.23 mg , DA 47.40 mg ,

12、5-HT 53.18 mg ,分別溶于 0.1 mol/L HCl 中 , 并定容于 25 mL 容量瓶, 制成標(biāo)準(zhǔn)品儲備液(NE 5mmol/L , DA 10 mmol/L , 5-HT 10 mmol/L)。再按需要用 0.1 mol/L HCl 稀釋成各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。腦勻漿樣品的制備:小鼠直接斷頭 ,在冰臺上剝離出小鼠全腦(保留大腦及間腦), 稱重。按 0.1 g 腦(濕重)加入 1 mL 5 %高氯酸的比例加入高氯酸 ,

13、放入玻璃勻漿管內(nèi), 冰浴下勻漿。將勻漿液收集于 1.5 mL 離心管中 , 于 13 000 r/min 下低溫離心 20 min,取上清液進(jìn)樣檢測。1 .3 色譜條件 色譜條件Shim-pack C18 柱, 6.0 mm i.d.×150 mm , 5μm ;流動相:0.1 mol/L 的 KH2PO4 緩沖液-甲醇(體積比為 9 1)。單泵流速線性梯度程序 :0.5 mL/min10 min 1 mL/min 2 .5

14、 min 1.5 mL/min (保持 180.5 mL/min;進(jìn)樣環(huán)體積為 20 μL ;柱溫為室溫 ;熒光檢測器的激發(fā)波長為 254 nm , 發(fā)射波長為 338 nm 。2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2 .1 線性范圍和檢測限 線性范圍和檢測限采用外標(biāo)法 ,以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣測定, 以峰面積 Y 為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣濃度 X(μmol/L)為橫坐標(biāo)作圖 ,計(jì)算出線性回歸方程(如表 1)。以 S /N =3 計(jì)得到方法的最低檢測限分別

15、為:NE 5 nmol/L , DA10 nmol/L ,5-HT 5 nmol/L 。表 1 NE, DA 和 5-HT 的線性回歸方程 的線性回歸方程Table 1 Regression equations of NE, DA and 5-HTLinear range/ Reg ression Compound r(μmol/ L) equation＊NE 0 .05-20 Y =547740X +4302 .8 0 .9999D

16、A 0 .10-25 Y =379769X 0 .98915-HT 0 .005-1 .2 Y =8 ×106X 0 .9997＊ Y :Peak area;X :concentration of sample, μmol/ L.2 .2 色譜分離和保留時(shí)間 色譜分離和保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)液和腦勻漿樣品中的 NE , DA 和 5-HT 的峰之間分離較好(樣品中 NE 與雜質(zhì)峰的分離尚有待改善),保留時(shí)間分別在 5 , 7 和 12