酮泛解酸內(nèi)酯還原酶的克隆表達(dá)及其在高效不對稱合成D-泛解酸內(nèi)酯中的應(yīng)用.pdf

1、D-泛酸，俗稱維生素B5，可以維持頭發(fā)，血液和皮膚的健康，同時它可以作為輔酶A的前體。目前，主要以D-泛解酸內(nèi)酯和β-丙氨酸為原料通過化學(xué)法合成D-泛酸。前體D-泛解酸內(nèi)酯主要通過化學(xué)法合成和水解酶動力學(xué)拆分獲得，但化學(xué)法步驟繁瑣，污染環(huán)境，而水解酶拆分過程中需要化學(xué)外消旋化和酸化內(nèi)酯化過程，增大了額外的生產(chǎn)成本。因此，開發(fā)全新的D-泛解酸內(nèi)酯合成工藝具有非常大的意義。
　　本文以釀酒酵母基因組為模板，成功克隆出酮泛解酸內(nèi)酯還原酶

2、基因SceCPR1，并成功構(gòu)建了SceCPR1與葡萄糖脫氫酶EsGDH偶聯(lián)的輔酶循環(huán)再生系統(tǒng)，即“一菌雙酶”體系，用于高效不對稱還原酮泛解酸內(nèi)酯獲得D-泛解酸內(nèi)酯;SceCPR1和EsGDH蛋白分子大小分別為35kDa和27kDa。通過誘導(dǎo)條件優(yōu)化，最終單位濕菌體中SceCPR1和EsGDH的酶活分別為1179.2U/g和442.8U/g。
　　SceCPR1酶學(xué)性質(zhì)表征發(fā)現(xiàn)，其最適的pH為5.5，溫度45℃，并且酶在45℃下容易

3、變性，但當(dāng)添加5mM的NADPH可以保證其溫度穩(wěn)定性;其次，SceCPR1不屬于金屬離子依賴型還原酶，但是5mM的Fe3+以及大多數(shù)有機(jī)溶劑對酶活力有抑制作用;底物譜研究發(fā)現(xiàn)該酶對于酮泛解酸內(nèi)酯具有最高的活力，而對于酮泛解酸以及D-或L-泛解酸內(nèi)酯都無活力;在低底物濃度條件下，測定了SceCPR1的動力學(xué)參數(shù)，SceCPR1對酮泛解酸內(nèi)酯和NADPH的Km值分別為0.164mM和0.029mM，反應(yīng)的Vmax分別為131.03U/mg和

4、137.81U/mg。
　　以BL21(DE3)/pACYCDuet1-SceCPR1/EsGDH的凍干細(xì)胞作為生物催化劑，優(yōu)化全細(xì)胞催化條件，確定最適反應(yīng)pH為5.5，溫度35℃，生物催化劑添加量為0.03g/mL，輔底物葡萄糖與底物配比為1.5∶1.0，攪拌速度400rpm;通過對底物水解的研究，發(fā)現(xiàn)底物自發(fā)水解是影響產(chǎn)物得率的關(guān)鍵因素。因此，在最適催化條件下，將酮泛解酸內(nèi)酯和葡萄糖溶解于pH2.5的溶液中，采用持續(xù)流加補(bǔ)料的