新型水溶性對稱五甲川吲哚菁染料的合成及生物應用.pdf

1、目的：吲哚菁染料是一種近紅外熒光染料，具有量子產(chǎn)率高、摩爾消光系數(shù)大、多共軛結構特征、信噪比高、光譜范圍廣、無放射性等優(yōu)點，已應用于多個領域，尤其在生物醫(yī)學領域，可用于基因探測、蛋白檢測、腫瘤靶向治療、光動力學治療、熒光探針等方面。隨著生物技術的發(fā)展，已合成的吲哚菁染料不論在性能上、還是在數(shù)量上均不能滿足應用的需求。因此，研究開發(fā)性質優(yōu)良的吲哚菁染料，對生物醫(yī)學領域有著重要意義。本文設計合成一系列吲哚菁染料，在兩端吲哚“N”原子上連接非

2、離子親水基團PEG長醚鏈，合成對稱性五甲川吲哚菁染料，研究引入基團后對染料的合成方法、分離提純、光學性質及生物應用的影響，期望得到合成簡單、分離提純容易、水溶性更好、光學性質更加優(yōu)良的吲哚菁染料。
　　方法：以對溴甲基苯甲酸、4-磺酸基苯肼、聚三乙二醇、對甲基苯磺酰氯等為原料，采用“半菁法”合成一種五甲川吲哚菁染料Cy5-668和一種三甲川吲哚菁染料，用C18正相硅膠分離柱分離提純。以4-磺酸基苯肼、3-甲基-2-丁酮、聚三乙二醇

3、、對甲基苯磺酰氯、3，5-二羥基苯甲酸甲酯等為原料，采用“一步法”合成兩種對稱性五甲川吲哚菁染料，用甲醇、乙醚重結晶分離提純。用熒光分光光度計、紫外-可見分光光度計測定化合物的熒光發(fā)射光譜和紫外吸收光譜，用碘鎢燈照射測染料的光穩(wěn)定性曲線，測定兩種染料Cy5-666-1和Cy5-668在不同pH環(huán)境下熒光光譜和紫外光譜的變化。對四種染料進行活化得到活化酯，用于標記牛血清蛋白，計算染料-蛋白標示率。用兩種對稱性五甲川吲哚菁染Cy5-666-

4、1和Cy5-666-2對活細胞和固定細胞進行染色，觀察染色后細胞在熒光顯微鏡下的成像。
　　結果：合成了4種新型水溶性熒光染料及20余種中間體，經(jīng)1H NMR和MS表征確定為目標化合物。Cy5-666-1的最大吸收波長為653nm，最大發(fā)射波長為666nm，摩爾消光系數(shù)為1.5×105/M-1cm-1，熒光量子產(chǎn)率為0.093；Cy5-666-2的最大吸收波長為649nm，最大發(fā)射波長為666nm，摩爾消光系數(shù)為1.4×105/M

5、-1cm-1，熒光量子產(chǎn)率為0.082；Cy5-668的最大吸收波長為647nm，最大發(fā)射波長為668nm，摩爾消光系數(shù)為1.4×105/M-1cm-1，熒光量子產(chǎn)率為0.09；Cy3-569的最大吸收波長為554nm，最大發(fā)射波長為569nm，摩爾消光系數(shù)為0.9×105/M-1cm-1，熒光量子產(chǎn)率為0.07。4種染料均具有良好的水溶性及較高的光穩(wěn)定性，明顯高于參比染料，穩(wěn)定性次序依次為Cy3-569>C y5-666-1

6、>Cy5-666-2>Cy5-668。不同pH環(huán)境下Cy5-666-1呈現(xiàn)不同的熒光強度，當pH值在7.2附近時，熒光強度最大，在強酸或者強堿條件下，熒光強度減弱。Cy5-668也呈現(xiàn)不同的熒光性能，在酸性及弱堿性條件下，熒光強度基本不變，在強堿條件下，熒光減弱，當pH值達到13時，染料熒光強度急劇下降。
　　用四種染料的活化酯以不同摩爾比標記牛血清蛋白，當n(染料)：n(牛血清白蛋白)=5:1時，Cy5-666-1、Cy5-66

7、6-2、Cy5-668、Cy3-569對蛋白的標示率分別為1.35、1.26、1.13、1.16，當n(染料)：n(牛血清白蛋白)=10:1時，Cy5-666-1、Cy5-666-2、Cy5-668、Cy3-569對蛋白的標示率分別為1.89、1.76、1.59、1.61。，當n(染料)：n(牛血清白蛋白)=15:1時，Cy5-666-1、Cy5-666-2、Cy5-668、Cy3-569對蛋白的標示率分別為2.23、2.21、2.02

8、、2.04。
　　Cy5-666-1對固定細胞和活細胞染色具有明顯的差異性，固定細胞染色可發(fā)現(xiàn)染料穿過細胞膜，進入細胞質，聚集在細胞核上，可看清整個細胞被染色?；罴毎旧砂l(fā)現(xiàn)染料聚集在細胞膜上，有少量的染料透過細胞膜進入細胞質，可看清細胞外圍的大概輪廓，由此，可明顯區(qū)別活細胞和固定細胞。
　　結論：在兩端吲哚環(huán)“N”原子上引入兩個PEG長醚鏈非離子親水性基團，可有效減少合成步驟，降低分離提純難度，具有良好的水溶性，熒光量子