不產氧光合細菌砷代謝基因表達調控研究.pdf

1、目前，微生物單一砷代謝機制研究較為深入，但在一些微生物的砷代謝基因簇中，同時含有多個砷操縱子，例如，同時含有細胞質 As(V)還原和呼吸性As(V)還原操縱子（Shewanella sp. strain ANA-3），As(III)氧化與呼吸性As(V)還原操縱子（Herminiimonas arsenicoxydans）等。然而，對于同一微生物，不同砷操縱子中砷代謝基因之間的表達調控關系、以及如何協(xié)調對砷進行轉化或代謝的分子機制研究甚

2、少。這種同一微生物不同砷代謝機制之間的調控關系是目前微生物砷代謝機制研究的一個熱點和難點問題，闡明多操縱子基因的表達調控以及對環(huán)境砷的響應關系，對于深入理解微生物在砷的地球化學循環(huán)的重要作用、以及砷污染環(huán)境的微生物修復都具有重要意義。
　　不產氧光合細菌(Anoxygenic phototrophic bacteria，APB) Rhodopseudomonas palustris CGA009基因背景清楚，擁有細胞質As(V)還

3、原和As(III)甲基化的相關基因，其分布在3個砷操縱子上，有4個調控蛋白基因（arsR），可以作為研究多砷操縱子基因之間砷代謝基因表達調控的良好模型。本文以CGA009菌株為研究對象，首次從轉錄水平上探究了多個砷操縱子基因在不同砷環(huán)境條件下表達情況，闡明了砷與CGA009菌株3個操縱子基因的表達關系。在此基礎上，克隆表達并獲得了該菌株中的4個砷代謝調控蛋白（ArsR），并探究了ArsR與其中1個ars operon操縱區(qū)相互作用，以揭

4、示CGA009菌株的3個ars operon在不同條件下表達調控的原因。還獲得1株對砷具有高吸附特性的砷代謝調控蛋白重組菌株，研究了其對砷的吸附特性。主要結果如下：
　　采用分光光度法和real-time PCR方法，研究了砷對該菌株生長影響以及3個 ars operon基因的表達情況。結果表明：光照厭氧條件下，As(V)和As(III)對CGA009菌株生長抑制的半數(shù)效應濃度（EC50）分別為2.44 mmol/L和1.55 m

5、mol/L，表明該菌株對砷具有良好的抗性。在As(III)和As(V)誘導下，ars2和ars3 operon基因能表達，但ars1 operon基因不表達。隨著As(III)濃度的升高，ars2和ars3 operon基因表達量也隨之升高。在低濃度（<1×10-6 mol/L）As(III)時即可誘導ars2 operon表達，繼續(xù)升高As(III)濃度，能誘導ars2和ars3 operon同時表達，但ars2 ope ron的表達

6、量更高，當升高至1×10-3 mol/L As(III)時，二者表達量無明顯差別。As(V)存在時，ars2 operon和ars3 operon均在對數(shù)前期表達量最高，隨著細菌生長，生物量升高，這2個operon砷代謝基因的表達量逐漸降低。因此，從轉錄水平可知，環(huán)境中As(III)濃度較低時，該菌株可通過細胞質 As(V)還原和As(III)外排的機制代謝砷，高濃度 As(III)時，除了 As(V)還原和As(III)外排外，還應同

7、時具有As(III)甲基化作用。
　　構建CGA009菌株4個arsR基因表達載體，將其轉化到表達宿主菌E.coli BL21(DE3)表達，Ni-NTA純化，得到這4個 ArsR蛋白。通過凝膠滯緩試驗（EMSA）檢測這4個ArsR蛋白與ars1和ars2 operon的操縱區(qū)序列pars1和pars2的相互作用關系，結果顯示4個蛋白都能分別與pars1和pars2作用，說明CGA009菌株的4個ArsR蛋白能參與調控ars1和a

8、rs2 operon的表達。50 mmol/L As(III)能夠使這4個ArsR蛋白與pars1的復合物解離，表明ars1 operon的表達可能受高濃度As(III)誘導，但有待進一步驗證。
　　4個arsR基因的重組E.coli菌株對3.0 mmol/L As(III)的抗性能力測定，其中 E.coli(ArsR2)的抗性最高。采用原子熒光光譜法探究 E.coli(ArsR2)對砷吸附特征，結果顯示：與對照菌株相比，E.co

9、li(ArsR2)對As(III)和As(V)的吸附能力分別提高了3.8倍和2.6倍，說明E.coli(ArsR2)對As(III)和As(V)具有較好吸附作用。該重組菌株對As(III)和As(V)的吸附的熱力學過程均符合Langmuir模型。約50 min時E.coli(ArsR2)對As(III)吸附達到吸附平衡，吸附動力學過程符合偽一級動力學模型。pH7時，E.coli(ArsR2)對As(III)吸附量最大，pH8時對As(V