qpcr實(shí)驗(yàn)操作流程

1、1Q-PCR 實(shí)驗(yàn)流程 實(shí)驗(yàn)流程一、 一、 ①實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備，每天早上到實(shí)驗(yàn)室后，先把超凈工作臺(tái)的紫外燈打 ①實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備，每天早上到實(shí)驗(yàn)室后，先把超凈工作臺(tái)的紫外燈打開 15-20 分鐘。②超凈臺(tái)前做實(shí)驗(yàn)，需佩戴干凈的橡膠手套 分鐘。②超凈臺(tái)前做實(shí)驗(yàn)，需佩戴干凈的橡膠手套/一次性 一次性薄膜手套， 薄膜手套，RNA 抽提需帶口罩。③取 抽提需帶口罩。③取 EP 管/槍頭時(shí)需用鑷子，不可 槍頭時(shí)需用鑷子，不可以用使用過(guò)的手套直接取用。取完 以

2、用使用過(guò)的手套直接取用。取完 EP 管/槍頭后，袋子及時(shí)封好。 槍頭后，袋子及時(shí)封好。④橡膠手套須放入超凈臺(tái)照射紫外，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中不得帶出超凈 ④橡膠手套須放入超凈臺(tái)照射紫外，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中不得帶出超凈臺(tái)，移液器在一天工作結(jié)束后調(diào)至最大量程，并用 臺(tái)，移液器在一天工作結(jié)束后調(diào)至最大量程，并用 75%乙醇清潔移 乙醇清潔移液器，槍頭盒及超凈臺(tái)面。⑤實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的過(guò)程中或觀看實(shí)驗(yàn)時(shí)，沒 液器，槍頭盒及超凈臺(tái)面。⑤實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的過(guò)程中或觀看實(shí)驗(yàn)時(shí)，

3、沒有帶口罩不要在超凈臺(tái)前講話。 有帶口罩不要在超凈臺(tái)前講話。二、 二、 總 RNA 抽提 抽提1）細(xì)胞培養(yǎng)皿中細(xì)胞樣品用 1*PBS 洗兩次后，用 1ml 槍將 PBS 吸干凈，加入 1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混勻，并吸至 1.5ml RNase free EP 管中使細(xì)胞充分裂解，室溫靜置 5min；組織樣品用液氮充分研磨，加入 1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混勻，室溫放置 5

4、min 使其充分裂解；（管蓋與管壁都需標(biāo)記樣品名稱）2） 加入 200μl 氯仿，劇烈振蕩混勻 30s，使水相和有機(jī)相充分接觸，室溫靜置 3-5min；（離心時(shí)離心管按順序排放，離心完畢，離心管的順序也按順序排好，與第一步的順序一致）3） 4℃下，14,000g 離心 15min，可見分為三層，RNA 在上層水相，移至另一個(gè)新的 RNase free EP 管；（用 20-200ul 的槍吸取上清，吸上清時(shí)，槍頭應(yīng)沿著液面上層吸取上清

5、，槍頭不可碰到、吸到中間層）4） 沉淀 RNA：加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒 6-8 次）（不應(yīng)用振蕩器混勻），室溫靜置 10min；5）4℃下，14,000g 離心 10min，收集 RNA 沉淀（如離心后仍不見 EP 管底部有沉淀，應(yīng)將 EP 管放置在-80 度冰箱過(guò)夜，繼續(xù)在 4℃下，14,000g離心 10min，收集 RNA 沉淀），去上清；6）用 75％乙醇洗滌兩次（12,000g 離心 5min）（加入乙醇后只需

6、輕輕顛倒 EP 管即可，不用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀），超凈臺(tái)風(fēng)干；沉淀31. mRNA：1) 在 RNase free 的 PCR 管中配置下列溶液.2) 將上述溶液吹打均勻，置 85℃保溫 5min，使 RNA 變性。隨后立即冰上致冷， 以防止 RNA 復(fù)性；3) 在該 PCR 管中加入下列試劑（Promega）oligo（dT）Random primer 10mM dNTP

7、 RNase inhibitor 5 x buffer M-MLV 0.50.52.00.54.00.5µlµlµlµlµlµl總體積 8.0 µl4) 將上述 20μl 反應(yīng)溶液 30℃保溫 10min；5) 42℃保溫 50min；6) 85℃保溫 10min；7) -20℃保存。2. microRNA：使用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)