可溶性Corin的表達、純化及功能研究.pdf

1、第一部分 PCSK6對可溶性Corin活化作用的研究
　　研究目的：
　　Corin是一種從心臟中克隆出的Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶，其主要功能是將心房利鈉肽前體（pro-atrial natriuretic peptide，pro-ANP）轉(zhuǎn)化為有活性的心鈉肽（ANP），從而發(fā)揮排鈉利尿、舒張血管、降低血壓和調(diào)節(jié)心臟功能的作用。在前期研究中，我們及其他課題組研究發(fā)現(xiàn)多個與高血壓病發(fā)生相關(guān)的Corin基因突變及多態(tài)性，并證實這些基

2、因變異影響Corin的功能。還發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者血漿中可溶性Corin水平顯著低于正常人，且降低程度與心衰嚴重程度相關(guān)。這些結(jié)果說明Corin缺乏或功能障礙可能會導(dǎo)致高血壓及心衰等心血管疾病的發(fā)生。同時還有研究報道，在小鼠心衰模型研究中發(fā)現(xiàn)，過表達Corin能改善心功能，延長小鼠生存期。提示，補充外源性Corin，提高機體內(nèi)Corin水平及活性，或許可作為治療心衰的新方法。
　　由于 Corin是一個膜蛋白，不利于大量表達純化，如能

3、制備分泌型的可溶性Corin將解決這一難題。據(jù)報道缺失胞內(nèi)段及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)不影響Corin的表達及活性。這一發(fā)現(xiàn)也使我們研制有活性的可溶性Corin成為可能。
　　同其他Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶一樣，Corin是以酶原形式合成的，需要在其它蛋白酶的活化后才具有功能。因此，Corin的活化是其作為心血管蛋白酶發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。最近 Chen等研究發(fā)現(xiàn)前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素6（Proprotein convertase subtilisi

4、n/ kextin type6，PCSK6）為Corin的活化酶。然而目前尚不清楚可溶性Corin能否被PCSK6剪切活化，從而使可溶性Corin具有活性。
　　本部分研究中，我們將構(gòu)建可溶性Corin和PCSK6的表達載體，轉(zhuǎn)染細胞，表達可溶性Corin和PCSK6，并檢測PCSK6對可溶性Corin的活化作用。
　　研究方法：
　　1.以野生型 Corin質(zhì)粒為模板，利用 PCR方法、酶連等方法構(gòu)建出可溶性Cori

5、n的表達載體“pSECsolCorin”及Corin突變體“R801A”和“S985A”。
　　2.將野生型、可溶性 Corin及突變 Corin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人胚胎腎（Human embryonic kidney，HEK）293細胞，收集培養(yǎng)上清，并制備細胞裂解液，蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting）檢測重組Corin蛋白在上清及胞漿內(nèi)的表達。
　　3.建立 HEK293-PCSK6穩(wěn)定表達細胞系，分別收集表達

6、可溶性 Corin及PCSK6的細胞上清，將可溶性Corin上清與不同體積的PCSK6上清孵育，Western blotting檢測可溶性Corin的活化情況。
　　4.收集pro-ANP上清液，將PCSK6活化的可溶性Corin上清以體積梯度加入 pro-ANP上清中并孵育，用免疫共沉淀（Immunoprecipitation，IP）和 Western blotting檢測的pro-ANP活化情況，從細胞水平研究可溶性Corin

7、的活化、表達及生物學(xué)功能。
　　研究結(jié)果：
　　1.我們構(gòu)建了缺失胞內(nèi)段及跨膜區(qū)的可溶性Corin表達載體。將野生型、可溶性Corin及突變體R801A和S985A分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞，Western blotting檢測Corin蛋白在上清及胞漿內(nèi)的表達。發(fā)現(xiàn)胞漿中Corin質(zhì)粒均成功表達，在還原條件下，二硫鍵打開，在野生型Corin及蛋白酶活化位點突變體S985A可檢測到~40 kDa的還原條帶，而可溶性Corin和

8、活化切割位點突變體R801A則未檢測到還原條帶。同時，檢測到可溶性Corin在上清中的表達，相對分子量約150 kDa。提示我們成功構(gòu)建可溶性Corin表達載體。
　　2.我們向HEK293細胞轉(zhuǎn)染PCSK6表達載體，進行篩選，1月后得到6株HEK293-PCSK6穩(wěn)定表達細胞系。收集上清，與含可溶性Corin的上清共同孵育，Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)PCSK6可以切割可溶性Corin使其產(chǎn)生~40kDa的活化條帶，

9、并呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　3.我們將已與PCSK6作用過的可溶性Corin加入到pro-ANP上清液中，發(fā)現(xiàn)可溶性Corin具有將pro-ANP活化為ANP的功能，并呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　結(jié)論：
　　我們構(gòu)建了可溶性Corin表達載體，DNA測序正確，并能在HEK293中表達。建立HEK293-PCSK6穩(wěn)定表達細胞系。發(fā)現(xiàn)PCSK6可以活化可溶性Corin，活化后的可溶性Corin具有將pro-ANP轉(zhuǎn)化為ANP的功能

10、。本研究為我們進一步將可溶性Corin蛋白純化并活化后用于心力衰竭的治療打下重要的基礎(chǔ)。
　　第二部分重組可溶性EKCorin蛋白的表達、純化及活性研究
　　研究目的：
　　Corin作為一種重要的心血管蛋白酶，具有排鈉利尿、舒張血管、降低血壓和調(diào)節(jié)心臟功能的作用。Corin的缺乏或功能障礙與高血壓及心衰等心血管疾病的發(fā)生相關(guān)。鑒于目前頑固性心衰的治療方法和效果均十分有限，因此研制具有生物學(xué)活性的可溶性Corin具有重

11、大意義，有望開發(fā)成為新型的抗心衰藥物，造福于廣大心衰患者。
　　第一部分我們研究證實可溶性Corin可以被PCSK6所活化，活化的Corin也具有生物學(xué)功能。但是，由于工具細胞HEK293細胞本身可表達內(nèi)源性PCSK6，這將自發(fā)的活化部分Corin蛋白，催化其自身降解；另一方面，目前尚無商品化的PCSK6，PCSK6的表達純化也是實驗的瓶頸。因此為使制備大量的有活性的可溶性Corin蛋白成為可能，我們對可溶性Corin蛋白的結(jié)構(gòu)進

12、行改造，在其保守活化位點引入腸激酶（Enterokinase，EK）識別序列，可以用商品化的EK來活化重組蛋白，實現(xiàn)了對蛋白活性的特異性調(diào)控。為后期制備大量的具有穩(wěn)定生物學(xué)活性的重組可溶性Corin奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　1.以EKCorin質(zhì)粒（Corin切割活化位點第801位的精氨酸被腸激酶的活化位點取代）為模板，運用 PCR、連接及轉(zhuǎn)化等分子克隆技術(shù)構(gòu)建帶有EK識別序列的可溶性Corin表達載體pSECEKso

13、lCorin。
　　2.將pSECEKsolCorin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎293細胞，用潮霉素（50μg/mL）進行篩選，約1月后得到HEK293-EKsolCorin穩(wěn)定表達細胞系，利用Western blotting檢測可溶性Corin的表達及蛋白分子量大小，用ELISA方法檢測可溶性Corin的表達量。
　　3.收集HEK293-EKsolCorin穩(wěn)定表達細胞的上清，經(jīng)過鎳柱親和層析分離純化收取目的蛋白，然后利用考馬斯亮

14、藍染色及Western blotting初步鑒定蛋白純度及分子量大小，BCA法測定蛋白濃度。
　　4.用濃度梯度的EK活化重組蛋白EKsolCorin。
　　5.通過pro-ANP活化實驗檢測純化蛋白的生物學(xué)活性。
　　研究結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建帶有EK識別序列的可溶性Corin表達載體pSECEKsolCorin。
　　2.獲得150株EKsolCorin穩(wěn)定細胞系，最終篩選出25株表達量大于0.1μg

15、/mL的細胞株。
　　3.鎳柱親和層析得到的純化蛋白，純度約為70％。
　　4. EK作用后的EKsolCorin蛋白具有活化pro-ANP的功能。
　　結(jié)論：
　　我們構(gòu)建了帶有EK識別序列的可溶性Corin表達載體，DNA測序正確，并能在HEK293中表達，建立了高表達EKsolCorin的穩(wěn)定細胞系。利用鎳柱親和層析純化得到目的蛋白EKsolCorin，并用EK剪切活化，得到具有活性的可溶性Corin。本研