固定化酶微反應(yīng)器—毛細(xì)管電泳法在線篩選酶抑制劑的研究.pdf

1、天然產(chǎn)物一直是新藥發(fā)現(xiàn)的源泉，而酶是藥物篩選的重要靶標(biāo)，許多疾病如艾滋病、腫瘤、癌癥、高血壓、老年癡呆癥等的藥物都是各種酶的抑制劑。在藥物的高通量篩選中，試劑成本大約占所有篩選費(fèi)用的四分之三，將篩選技術(shù)微型化可大大降低篩選成本。毛細(xì)管電泳(CE)具有分離效率高，分析速度快，消耗試劑少等優(yōu)點(diǎn)，可作為酶抑制劑的高效篩選平臺(tái)。用合適的固載化酶方法，使酶分子自組裝在毛細(xì)管柱頭，形成毛細(xì)管固定化酶微反應(yīng)器，結(jié)合CE法在線研究酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和抑制動(dòng)力

2、學(xué)，既可減小試劑消耗量，又簡(jiǎn)化測(cè)試步驟，實(shí)現(xiàn)酶抑制劑的高通量篩選。具體篩選步驟為:將待篩選的天然產(chǎn)物粗提物與底物混合后進(jìn)樣，使其在酶微反應(yīng)器中充分反應(yīng)，然后用CE法測(cè)定產(chǎn)物峰面積（或峰高），對(duì)照僅底物進(jìn)樣時(shí)的產(chǎn)物峰面積（或峰高），計(jì)算出其抑制程度，判斷待篩選的粗提物中是否存在已知酶的抑制劑。該篩選方法簡(jiǎn)單易行、自動(dòng)化程度高，可望用于天然產(chǎn)物粗提物中酶抑制劑的高通量篩選。
　　 在前人研究的基礎(chǔ)上，本文制備了兩種毛細(xì)管固定化酶微反

3、應(yīng)器，結(jié)合毛細(xì)管電泳法研究了酶促動(dòng)力學(xué)和酶抑制動(dòng)力學(xué)，并成功在線篩選了天然產(chǎn)物粗提物中酶抑制劑。本文主要涉及以下兩個(gè)部分的工作:
　　 (1)成功制備了一個(gè)毛細(xì)管固定化乙酰膽堿酯酶(AChE)微反應(yīng)器，結(jié)合CE技術(shù)，研究了固定化乙酰膽堿酯酶的酶促動(dòng)力學(xué)和酶抑制動(dòng)力學(xué)，并對(duì)天然產(chǎn)物中酶抑制劑進(jìn)行在線篩選。NaOH活化后的毛細(xì)管導(dǎo)入一段約2.9 cm長(zhǎng)的聚陽(yáng)離子溶液（聚乙烯亞胺），使此段毛細(xì)管帶上正電荷，然后帶負(fù)電荷的酶溶液通過靜電

4、作用吸附在此段毛細(xì)管內(nèi)壁上，再通過海藻酸鈣凝膠作用及殼聚糖的成膜作用在AChE表面上形成一層生物覆膜，于毛細(xì)管進(jìn)樣端形成一段大約2.9 cm長(zhǎng)的固定化AChE微反應(yīng)器。毛細(xì)管剩余部分作為AChE酶促反應(yīng)產(chǎn)物和未反應(yīng)完的底物的分離通道，采用產(chǎn)物的峰面積作為定量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)研究AChE的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及其抑制動(dòng)力學(xué)。10 mmol L-1底物（無(wú)抑制劑或存在抑制劑）導(dǎo)入微反應(yīng)器中，37℃下孵化2 min，以20 mmol L-1 Tris-HCl

5、(pH8.0)為分離緩沖溶液，在分離電壓25 kV、分離溫度37℃的條件下，產(chǎn)物和底物3 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離。對(duì)影響固定化AChE酶活性的各種因素，如緩沖溶液類型及濃度、孵化時(shí)間、底物濃度等條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇。在最優(yōu)條件下，測(cè)定固定化AChE的米氏常數(shù)Km、對(duì)抑制劑石杉?jí)A甲的抑制動(dòng)力學(xué)常數(shù)Ki及半數(shù)抑制濃度IC50依次為0.66mmol L-1、0.551μmol L-1、1.52μmol L-1。所建立的方法簡(jiǎn)單、高效、可靠，成功用

6、于由兩種已知的AChE抑制劑和30種天然產(chǎn)物組成的化合物庫(kù)的抑制劑篩選。
　　 (2)成功地制備了一個(gè)毛細(xì)管固定化胰蛋白酶微反應(yīng)器，結(jié)合毛細(xì)管電泳法，研究了固定化胰蛋白酶的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及抑制動(dòng)力學(xué)，對(duì)天然產(chǎn)物中該酶抑制劑進(jìn)行了在線篩選。經(jīng)NaOH、HCl、二次蒸餾水、甲醇依次預(yù)處理過的毛細(xì)管，真空吹干并升溫至40℃，然后導(dǎo)入約1.0 cm長(zhǎng)的3-氨丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液，充分反應(yīng)后再導(dǎo)入等長(zhǎng)度的戊二醛溶液，反應(yīng)完畢后再導(dǎo)入

7、等長(zhǎng)度的胰蛋白酶溶液，25℃下充分交聯(lián)，形成一個(gè)約1.0 cm長(zhǎng)的固定化胰蛋白酶微反應(yīng)器。毛細(xì)管剩余部分作為胰蛋白酶酶促反應(yīng)產(chǎn)物和未反應(yīng)完的底物的分離通道，采用產(chǎn)物的峰高作為定量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)研究胰蛋白酶的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及其抑制動(dòng)力學(xué)。10 mmol L-1底物（無(wú)抑制劑或存在抑制劑）導(dǎo)入微反應(yīng)器中，37℃下孵化2 min，以50 mmol L-1 Tris-HCl(pH8.0)作為分離緩沖溶液，在分離電壓25kV、分離溫度37℃的條件下，產(chǎn)物

8、和底物3.5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離。影響產(chǎn)物、底物的分離和固定化胰蛋白酶活性的各種因素，如緩沖溶液類型及濃度、pH值、分離電壓、孵化時(shí)間及溫度、底物濃度等條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇。在最優(yōu)條件下，測(cè)定固定化胰蛋白酶的米氏常數(shù)Km、對(duì)抑制劑苯甲脒鹽酸鹽的抑制動(dòng)力學(xué)常數(shù)Ki及半數(shù)抑制濃度IC50依次為3.16 mmol L-1、12.9 mmol L-1、3.98 mmol L-1。該方法簡(jiǎn)單、高效、可靠，成功用于從19種天然產(chǎn)物粗提物中篩選胰蛋白