氨肽酶N抑制劑毛細管電泳在線篩選方法的研究.pdf

1、氨肽酶N(Aminopeptidase N，APN)是屬于鋅離子依賴性金屬蛋白酶的一類膜結合型外肽酶，以同源二聚體結構存在于細胞膜。APN廣泛存在于大腦、腎、肝臟、胎盤和子宮等。與正常細胞相比，APN在癌細胞表面高水平表達，對腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤新血管的形成起著重要的作用，被稱為腫瘤細胞表面相關抗原CD13。近年來，以APN為靶點的腫瘤治療策略迅速發(fā)展起來，APN抑制劑已經(jīng)成為抗癌藥物研究的熱點課題。因此，發(fā)展和建立快速、可靠及高

2、通量APN抑制劑篩選方法對于研發(fā)新藥物具有十分重要的現(xiàn)實意義。
　　毛細管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)具有樣品消耗量少、分離效率高、分析時間短及自動化程度高等優(yōu)點，被廣泛應用于酶反應的測定中，成為了酶活性及酶抑制劑篩選研究常使用的分析手段。電泳調(diào)控微分析法(Electrophoretically Mediated Microanalysis，EMMA)是以毛細管電泳柱進樣端約1.5～2.0 cm

3、部分作為反應的微室，將酶溶液和底物溶液依次進樣到毛細管中，接著施加一段時間小電壓讓酶和底物溶液在毛細管中充分混合并反應，當酶促反應進行完畢后，加一高電壓對酶促反應生成的產(chǎn)物和未反應的底物進行分離，隨后進行檢測。該法在同一根毛細管內(nèi)集成了混合、反應、分離及檢測的全過程。本課題建立了APN抑制劑的毛細管電泳在線篩選方法，為抗腫瘤藥物的研究開發(fā)提供了新的篩選模型。主要研究工作和成果如下:
　　1.本文建立了APN抑制劑EMMA篩選方法，

4、并將該法應用于APN抑制劑的活性篩選研究中。電泳條件采用熔融石英毛細管(內(nèi)徑75μm，有效長度為50cm)，柱溫37℃，分離體系30 mM HEPES緩沖溶液含40 mM脫氧膽酸鈉(pH7.7)，分離電壓25 kV，二極管陣列檢測器(DAD)檢測波長為380 nm。EMMA法中，孵育緩沖溶液（50 mM磷酸鹽緩沖溶液，pH7.7）、APN溶液、底物溶液（含內(nèi)標）及孵育緩沖溶液液依次在0.5 psi壓力下分別進樣10s，在±2.0 kV各

5、加壓6s使酶和底物混合，在+1.0 kV電壓，孵育2 min后，在毛細管兩端加25 kV電壓，經(jīng)酶解后生成的產(chǎn)物、內(nèi)標與未完全反應剩余的底物，在電滲作用下進入毛細管分離區(qū)，依據(jù)各自遷移速率的不同而實現(xiàn)電泳分離。利用建立的方法測定了氨肽酶N的動力學參數(shù)（Km和Vmax）發(fā)現(xiàn)測得的動力學參數(shù)值與文獻報道值一致，以此證明在該模型中酶的活性保持良好。以烏苯美司為陽性對照，用所建立的方法制作量-效曲線同時測定其IC50，與文獻報道的酶標法測定值比

6、較，驗證了篩選方法的可行性。最后采用EMMA氨肽酶N抑制劑篩選方法從山東大學藥學院藥物化學研究所提供的以APN為靶點合成的29個合成新化合物（包括2個化合物粗合成物，含量約50％）進行APN抑制劑的篩選研究。
　　2.通過細胞膜制備技術得到高表達APN的人卵巢透明細胞癌細胞(ES-2)的細胞膜，測定細胞膜蛋白質(zhì)含量和膜APN活性對其進行表征后，將活性細胞膜填充至毛細管進樣端形成酶促反應微室，毛細管剩余部分作為酶促反應產(chǎn)物和未反應完

7、的底物的分離通道，建立了APN抑制劑的細胞膜毛細管電泳篩選方法。烏苯美司作為陽性抑制劑，用所建立的方法制作量-效曲線同時測得烏苯美司的半抑制劑濃度IC50值為19.3μM，與文獻報道的烏苯美司的IC50值(20.5μM)結果一致。順鉑為陰性抑制劑并選擇以低表達APN的人慢性髓系白血病細胞(K562)的細胞膜作陰性對照實驗，驗證了篩選方法的可行性。利用建立的細胞膜毛細管電泳法測定了細胞膜上APN的酶促動力學參數(shù)(Km)發(fā)現(xiàn)測得的細胞膜上A