小鼠睪丸畸胎瘤F9轉(zhuǎn)移關(guān)鍵基因的篩選和鑒定.pdf

1、惡性腫瘤己成為了危害人類健康的重大疾病之首，臨床上90％的惡性腫瘤病人死于腫瘤轉(zhuǎn)移。由于對腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的機(jī)制還不清楚，所以到目前臨床上針對腫瘤的轉(zhuǎn)移仍缺乏有效治療，因此研究控制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的分子病理機(jī)制是腫瘤防治措施的關(guān)鍵步驟。
　　 本研究運(yùn)用的全基因組隨機(jī)突變技術(shù)平臺，在基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的基因搜尋載體中引入了Tet-off基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，通過全基因組隨機(jī)插入和打開或關(guān)閉基因，導(dǎo)致不轉(zhuǎn)移或低轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞變成具

2、有高轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞，從而在全基因組范圍內(nèi)篩選得到與這種轉(zhuǎn)變具有因果關(guān)系的基因。臨床和腫瘤病理分析表明腫瘤的惡性程度與其分化程度有關(guān)，分化程度越低，惡性程度越高，轉(zhuǎn)移能力也就越強(qiáng)?；チ黾?xì)胞具有干細(xì)胞和低分化特性，多形成良性腫瘤，利用畸胎瘤和隨機(jī)基因突變技術(shù)來研究控制轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因?qū)⒔沂灸[瘤分化與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其分子病理機(jī)理。
　　 本研究以具有干細(xì)胞特性和轉(zhuǎn)移能力較低的小鼠睪丸畸胎瘤細(xì)胞F9作為模型，利用隨機(jī)基因突變技術(shù)進(jìn)

3、行全基因組范圍內(nèi)的隨機(jī)基因突變，建立了擁有109萬突變細(xì)胞克隆的全基因組突變庫，估計(jì)突變基因可以覆蓋基因組編碼基因3倍；突變細(xì)胞庫分別接種小鼠皮下、腹腔和尾靜脈，進(jìn)而體內(nèi)篩選和分離得到88株高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株；將這些高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株再次接種至動(dòng)物體內(nèi)，通過+/-Doxycyclin介導(dǎo)的基因突變和基因突變逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步體內(nèi)驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因突變與腫瘤轉(zhuǎn)移的因果關(guān)系，獲得114株高轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞株；通過SplinkerettePCR基因克隆和測序分析基因搜尋

4、載體插入位點(diǎn)和突變類型，確認(rèn)有32個(gè)基因突變與小鼠F9睪丸畸胎瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有因果關(guān)系，其中有己知在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用的基因，如Smadl、Tgfbr3、Ccnd3等，大部分基因在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用未見報(bào)道，包括WDR44、TSC22D1等基因。這些基因中Smad1、Tgfbr3、TSC22D1等多個(gè)基因都屬于與腫瘤轉(zhuǎn)移有重要關(guān)聯(lián)的TGFβ信號通路，其中TSC22D1處于該信號通路的下游，直接作用于效應(yīng)蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用，從而調(diào)控