致病性維氏氣單胞菌CL0901株菌蛻對鯉免疫功能和hepcidin基因表達影響研究.pdf

1、細菌性疾病作為水產(chǎn)動物疾病主要類型，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，同時一些人獸共患病原菌潛在威脅著人類健康。維氏氣單胞菌CL0901株是發(fā)病錦鯉體內(nèi)分離的一株革蘭氏陰性桿菌，具有較強致病性，感染魚體表出現(xiàn)潰瘍，病變部位鱗片脫落，肌肉外露等癥狀。目前針對細菌性疾病的化學方法和抗生素治療存在著很多弊端，相比之下疫苗接種是較安全有效手段，因此很多學者對用疫苗來提高水產(chǎn)動物免疫力進行了大量探索。而在諸多疫苗中，菌蛻是革蘭氏陰性菌被噬菌體PhiX17

2、4裂解基因 E的產(chǎn)物裂解后形成的完整細菌空殼，在滅活過程中與傳統(tǒng)的甲醛滅活苗比較，保留了完整細胞形態(tài)和表面抗原并且兼具一些佐劑的性質(zhì)，能夠直接刺激魚體免疫反應，使其成為新型疫苗重要候選者，但其研究偏重構(gòu)建方面，為推動此種疫苗發(fā)展和推廣，對其接種后引起水產(chǎn)動物免疫效應研究十分必要，查閱大量文獻發(fā)現(xiàn)，多數(shù)學者對水生動物接種疫苗后免疫效應機制探討都從特異性免疫即抗體效價和免疫保護率著手，對非特異性免疫反應及更深層次免疫相關基因研究很少。為了更

3、全面了解菌蛻疫苗對水產(chǎn)動物免疫效應，本研究用制備的致病性維氏氣單胞菌CL0901株菌蛻接種鯉，在實驗條件下研究了免疫菌蛻后鯉（Cyprinus carpio）特異性、非特異性免疫指標及hepcidin基因表達量的變化，綜合探討維氏氣單胞菌菌蛻對鯉免疫的影響，進一步為菌蛻疫苗在引起魚類免疫保護途徑和效果方面提供一些科學參考。
　　本論文主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　實驗條件下培養(yǎng)含有裂解基因E重組質(zhì)粒pBBR1MCS2-E的重

4、組維羅納氣單胞菌CL0901株，在42℃誘導裂解基因E表達12-16小時，收集菌蛻。在開始實驗的第1、15和29天使用菌蛻疫苗(CLGs)和甲醛滅活疫苗(FKC）對鯉進行注射3次免疫，并設一個注射PBS的對照組，每個組設3個重復。從第一次免疫后每隔7 d從每個重復中隨機取三尾魚進行取樣，最后進行攻毒實驗。對血清抗體滴度、相對免疫保護率(RPS)、溶菌酶(LZM)、呼吸爆發(fā)、補體C3、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化

5、酶(SOD)、堿性磷酸酶(ALP)及 hepcidin基因表達量進行測定。
　　（1）采用凝集抗體效價方法測定免疫維氏氣單胞菌 CL0901株菌蛻后鯉血清不同時間抗體效價變化，并對取樣后的受免魚體進行攻毒實驗，觀察死亡情況測定相對免疫保護率RPS，發(fā)現(xiàn)菌蛻組抗體凝集效價在免疫后35天達26-28，顯著高于FKC和PBS組（P＜0.05），并能維持一定時間；而且CLGs組的RPS為57.70％、FKC組RPS為30.77%。表明免疫

6、菌蛻能夠有效提升抗體水平并能起到良好免疫保護作用。
　?。?）用NBT法測定不同實驗組免疫魚體呼吸爆發(fā)作用并用相應的試劑盒測定血清中相關免疫酶類活性。結(jié)果顯示二次免疫后，CLGs組呼吸爆發(fā)、LZM、MPO含量顯著高于PBS組(P＜0.05)，MDA含量顯著低于PBS組(P＜0.05)；CLGs組C3含量在35和42 d顯著低于PBS組(P＜0.05)；ALP含量顯著低于FKC組和PBS組（P＜0.05）；SOD含量在7、28、42

7、天顯著低于PBS組（P＜0.05）；可以看出維氏氣單胞菌CL0901株菌蛻免疫的鯉，其非特異免疫在二次免疫后部分得到顯著增強。
　　（3）采用實時熒光定量的方法測定免疫相關基因表達量。免疫菌蛻后抗菌肽hepcidin基因表達主要發(fā)生在肝臟，脾臟次之，頭腎中最低，其中頭腎中CLGs組的hepcidin基因表達量在21天顯著高于FKC和PBS組（P＜0.05）；肝臟和脾臟中CLGs組的hepcidin基因表達量在28天均顯著高于FKC