致病性維氏氣單胞菌CL0901株菌蛻對(duì)鯉免疫功能和hepcidin基因表達(dá)影響研究.pdf

1、細(xì)菌性疾病作為水產(chǎn)動(dòng)物疾病主要類型，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，同時(shí)一些人獸共患病原菌潛在威脅著人類健康。維氏氣單胞菌CL0901株是發(fā)病錦鯉體內(nèi)分離的一株革蘭氏陰性桿菌，具有較強(qiáng)致病性，感染魚體表出現(xiàn)潰瘍，病變部位鱗片脫落，肌肉外露等癥狀。目前針對(duì)細(xì)菌性疾病的化學(xué)方法和抗生素治療存在著很多弊端，相比之下疫苗接種是較安全有效手段，因此很多學(xué)者對(duì)用疫苗來(lái)提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力進(jìn)行了大量探索。而在諸多疫苗中，菌蛻是革蘭氏陰性菌被噬菌體PhiX17

2、4裂解基因 E的產(chǎn)物裂解后形成的完整細(xì)菌空殼，在滅活過(guò)程中與傳統(tǒng)的甲醛滅活苗比較，保留了完整細(xì)胞形態(tài)和表面抗原并且兼具一些佐劑的性質(zhì)，能夠直接刺激魚體免疫反應(yīng)，使其成為新型疫苗重要候選者，但其研究偏重構(gòu)建方面，為推動(dòng)此種疫苗發(fā)展和推廣，對(duì)其接種后引起水產(chǎn)動(dòng)物免疫效應(yīng)研究十分必要，查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)學(xué)者對(duì)水生動(dòng)物接種疫苗后免疫效應(yīng)機(jī)制探討都從特異性免疫即抗體效價(jià)和免疫保護(hù)率著手，對(duì)非特異性免疫反應(yīng)及更深層次免疫相關(guān)基因研究很少。為了更

3、全面了解菌蛻疫苗對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫效應(yīng)，本研究用制備的致病性維氏氣單胞菌CL0901株菌蛻接種鯉，在實(shí)驗(yàn)條件下研究了免疫菌蛻后鯉（Cyprinus carpio）特異性、非特異性免疫指標(biāo)及hepcidin基因表達(dá)量的變化，綜合探討維氏氣單胞菌菌蛻對(duì)鯉免疫的影響，進(jìn)一步為菌蛻疫苗在引起魚類免疫保護(hù)途徑和效果方面提供一些科學(xué)參考。
　　本論文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)含有裂解基因E重組質(zhì)粒pBBR1MCS2-E的重

4、組維羅納氣單胞菌CL0901株，在42℃誘導(dǎo)裂解基因E表達(dá)12-16小時(shí)，收集菌蛻。在開始實(shí)驗(yàn)的第1、15和29天使用菌蛻疫苗(CLGs)和甲醛滅活疫苗(FKC）對(duì)鯉進(jìn)行注射3次免疫，并設(shè)一個(gè)注射PBS的對(duì)照組，每個(gè)組設(shè)3個(gè)重復(fù)。從第一次免疫后每隔7 d從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取三尾魚進(jìn)行取樣，最后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。對(duì)血清抗體滴度、相對(duì)免疫保護(hù)率(RPS)、溶菌酶(LZM)、呼吸爆發(fā)、補(bǔ)體C3、髓過(guò)氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化

5、酶(SOD)、堿性磷酸酶(ALP)及 hepcidin基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。
　?。?）采用凝集抗體效價(jià)方法測(cè)定免疫維氏氣單胞菌 CL0901株菌蛻后鯉血清不同時(shí)間抗體效價(jià)變化，并對(duì)取樣后的受免魚體進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，觀察死亡情況測(cè)定相對(duì)免疫保護(hù)率RPS，發(fā)現(xiàn)菌蛻組抗體凝集效價(jià)在免疫后35天達(dá)26-28，顯著高于FKC和PBS組（P＜0.05），并能維持一定時(shí)間；而且CLGs組的RPS為57.70％、FKC組RPS為30.77%。表明免疫

6、菌蛻能夠有效提升抗體水平并能起到良好免疫保護(hù)作用。
　　（2）用NBT法測(cè)定不同實(shí)驗(yàn)組免疫魚體呼吸爆發(fā)作用并用相應(yīng)的試劑盒測(cè)定血清中相關(guān)免疫酶類活性。結(jié)果顯示二次免疫后，CLGs組呼吸爆發(fā)、LZM、MPO含量顯著高于PBS組(P＜0.05)，MDA含量顯著低于PBS組(P＜0.05)；CLGs組C3含量在35和42 d顯著低于PBS組(P＜0.05)；ALP含量顯著低于FKC組和PBS組（P＜0.05）；SOD含量在7、28、42

7、天顯著低于PBS組（P＜0.05）；可以看出維氏氣單胞菌CL0901株菌蛻免疫的鯉，其非特異免疫在二次免疫后部分得到顯著增強(qiáng)。
　?。?）采用實(shí)時(shí)熒光定量的方法測(cè)定免疫相關(guān)基因表達(dá)量。免疫菌蛻后抗菌肽hepcidin基因表達(dá)主要發(fā)生在肝臟，脾臟次之，頭腎中最低，其中頭腎中CLGs組的hepcidin基因表達(dá)量在21天顯著高于FKC和PBS組（P＜0.05）；肝臟和脾臟中CLGs組的hepcidin基因表達(dá)量在28天均顯著高于FKC