蠐螬體內(nèi)環(huán)境對(duì)Bt殺蟲活性的影響.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，對(duì)多種農(nóng)林害蟲具有殺蟲活性，被廣泛應(yīng)用用作生物殺蟲劑。針對(duì)重要地下害蟲蠐螬，本實(shí)驗(yàn)室分離到多株對(duì)蠐螬有效的菌株，Bt菌株對(duì)于昆蟲作用過程主要包括，晶體蛋白破壞中腸上皮細(xì)胞，使中腸上皮發(fā)生破壞，產(chǎn)生孔洞，Bt及Bt芽胞通過這些孔洞，進(jìn)入昆蟲的血腔，增殖感染，最終導(dǎo)致蠐螬的敗血死亡。近期研究結(jié)果顯示，Cry8Ga等殺蟲蛋白可以高效破壞蠐螬中腸，但是Bt的進(jìn)一

2、步感染效率較低。針對(duì)上述現(xiàn)象，本論文一方面測(cè)定蠐螬中腸轉(zhuǎn)錄組，分析蠐螬免疫相關(guān)基因，探索蠐螬抵御Bt侵染的機(jī)制;另一方面，針對(duì)蠐螬腸道、血淋巴中的免疫效應(yīng)物，篩選耐受菌株，為進(jìn)一步開發(fā)蠐螬高效的Bt殺蟲劑提供思路，相關(guān)研究結(jié)果如下:
　　一、完成了大黑鰓金龜三齡幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組分析。分析結(jié)果顯示，蠐螬中腸中表達(dá)了多類與免疫相關(guān)的基因。1，中腸中表達(dá)了peptidoglycan recognition proteins等受體蛋白，該類

3、受體是昆蟲識(shí)別細(xì)菌的重要蛋白，將激活蠐螬的免疫途徑，表達(dá)分泌免疫效應(yīng)物;2，中腸中表達(dá)了高豐度的絲氨酸蛋白酶，該種蛋白酶主要分泌在消化道中，可能會(huì)對(duì)中腸中Bt細(xì)胞產(chǎn)生影響;3，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)還顯示蠐螬表達(dá)了defincin等免疫效應(yīng)物，這些免疫效應(yīng)物通常存在于昆蟲血淋巴中，可能會(huì)對(duì)侵入血淋巴的Bt產(chǎn)生抑制、殺滅作用。
　　二、完成了中腸中與免疫識(shí)別相關(guān)受體的克隆。1，完成識(shí)別革蘭氏陽性細(xì)菌的受體peptidoglycanrecogni

4、tion proteins（gprp）基因克隆，獲得了1個(gè)全長基因序列，BLSAT分析結(jié)果顯示，與東北大黑鰓金龜（Holotrichia diomphalia）的gprp-2基因相似性最高，為61％;2，完成了lectin基因克隆，獲得了3個(gè)全長基因序列，BLSAT分析結(jié)果顯示，分別與內(nèi)華達(dá)古白蟻（Zootermopsisnevadensis）的Endoplasmic reticulum lectin1基因相似性最高，相似性為53％;與

5、內(nèi)華達(dá)古白蟻（Zootermopsis nevadensis）的Malectin-B基因和Galectin-4基因相似性最高，相似性分別為62％和46％;于此同時(shí)完成了defencin免疫效應(yīng)物的基因克隆，獲得了2個(gè)全長基因序列，BLSAT分析結(jié)果顯示，分別與古銅異麗金龜(Anomala cuprea)的defensin B相似性最高，相似性分別為69％和62％。并且完成了中腸中表達(dá)量高的消化酶serineprotease基因的克隆，獲

6、得6個(gè)全長基因序列，BLSAT分析結(jié)果顯示，分別與致倦庫蚊（Culex quinquefasciatus）的trypsin-5基因相似度最高為30％，赤擬谷盜（Tribolium castaneum）serine protease-P76基因相似度最高為46％;新西蘭草地蠐螬（Costelytrazealandica）的serine protease-3基因相似度最高為82％，新西蘭草地蠐螬（Costelytrazealandica）的

7、serine protease-4基因相似度最高相似度為68％，大黑鰓金龜（Holotrichia oblita）serine protease1的基因相似度最高為48％，中華地鱉蟲（Eupolyphagasinensis）的serine protease的基因相似度最高為49％;，該部分工作為進(jìn)一步設(shè)計(jì)RNA干擾殺蟲劑提供了新靶點(diǎn)。
　　三、完成了161株Bt菌株對(duì)蠐螬中腸液耐受程度的測(cè)試。供試?yán)ハx是三齡的大黑鰓金龜幼蟲。檢測(cè)中

8、，共有74株Bt菌株對(duì)大黑鰓金龜幼蟲中腸液顯著耐受。上述結(jié)果顯示，Bt對(duì)蠐螬中腸液中的免疫效應(yīng)物的耐受性是多樣的，可以進(jìn)一步篩選高度耐受腸道液的Bt菌株，用于抗蠐螬Bt殺蟲劑的開發(fā)。
　　四、完成了對(duì)161株Bt菌株對(duì)蠐螬血淋巴耐受程度的測(cè)試。供試?yán)ハx包括三齡的大黑鰓金龜幼蟲和三齡的白星花金龜幼蟲;在對(duì)大黑鰓金龜幼蟲血淋巴的檢測(cè)中，共有87株Bt菌株對(duì)大黑鰓金龜幼蟲血淋巴顯著耐受;在對(duì)白星花金龜幼蟲血淋巴的檢測(cè)中，共有55株Bt菌

9、株對(duì)白星花金龜幼蟲血淋巴顯著耐受;上述結(jié)果顯示，Bt對(duì)蠐螬血淋巴中的免疫效應(yīng)物的耐受性是多樣的，可以進(jìn)一步通過篩選血淋巴高度耐受的Bt菌株，用于抗蠐螬Bt殺蟲劑的開發(fā)。
　　通過本論文研究結(jié)果顯示，蠐螬體內(nèi)具有針對(duì)多種微生物免疫識(shí)別受體及多種免疫效應(yīng)物，本研究克隆的受體基因和免疫效應(yīng)物基因可以為RNAi殺蟲劑開發(fā)提供新靶點(diǎn)。進(jìn)一步在Bt對(duì)蠐螬體內(nèi)免疫效應(yīng)物耐受測(cè)試顯示，存在對(duì)其免疫效應(yīng)物高度而耐受的菌株，相關(guān)菌株可以用于進(jìn)一步抗蠐