基于g-C3N4的光電化學(xué)傳感器對蛋白激酶A活性的檢測研究.pdf

1、蛋白激酶催化蛋白質(zhì)磷酸化是一種重要的生物代謝過程。并且在信號傳導(dǎo)、細胞增殖、激素分泌、細胞分化、基因表達和細胞凋亡等方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。據(jù)報道，突變的蛋白激酶活性和不正常的蛋白磷酸化過程與許多疾病有關(guān)，像免疫缺陷、癌癥、糖尿病和阿爾茨海默病等。在早期疾病檢測和治療功效評斷方面，蛋白激酶活性可能是一種新的標(biāo)志。因此，靈敏檢測蛋白激酶活性是至關(guān)重要的。目前，檢測蛋白激酶活性的方法有熒光法、光致發(fā)光、電致發(fā)光、拉曼光譜法、多光譜測定法和

2、共振光散射等，然而，這些方法具有難理解、檢測儀器昂貴、耗時、繁瑣的樣品處理和操作復(fù)雜的缺點。因此，建立特異性強、靈敏度高、簡單快捷的蛋白激酶活性檢測方法意義重大。本文基于類石墨相氮化碳(g-C3N4)和改性的 g-C3N4制備了四種光電化學(xué)傳感器，實現(xiàn)了蛋白激酶的靈敏快速的檢測。
　　(1)基于鋯離子與磷酸基團的識別作用和光信號分子磷酸化的g-C3N4的使用，我們提出了一種簡單靈敏的光電化學(xué)策略來檢測蛋白激酶 A(PKA)活性。在

3、最優(yōu)實驗條件下，隨著PKA濃度從0.05 U/mL增加到50 U/mL，光電流值成比例的增加，最低檢測限是0.077 U/mL。而且，本工作提出的光電化學(xué)實驗可以應(yīng)用于定量分析 PKA抑制劑。結(jié)果表明，鞣花酸的 IC50（半抑制濃度）約為9.1μM。另外，提出的實驗方法可以進一步檢測實際樣品中的 PKA活性，實際樣品包括健康人的血清和胃癌患者的血清，健康人的乳腺組織和乳腺癌患者的乳腺組織。因此，本工作構(gòu)建的實驗方法為低成本和高靈敏檢測激

4、酶A活性和抑制劑篩選提供了一個新穎簡單的檢測平臺。
　　(2)利用光電轉(zhuǎn)換材料硫化鎘量子點(CdS QDs)增強 g-C3N4的光電化學(xué)信號，我們構(gòu)建了一個靈敏的光電化學(xué)傳感器來檢測 PKA活性。實驗首先合成了復(fù)合材料 Au/g-C3N4，利用 Au-S鍵，將基質(zhì)多肽固定在電極上，進而在含巰基的三磷酸腺苷的作用下，PKA催化磷酸化，基質(zhì)多肽引入了含巰基的磷酸基團。通過CdS QDs和巰基的結(jié)合，將CdS QDs捕獲在電極上。光照條

5、件下，在CdS QDs和g-C3N4的協(xié)同作用下，光電流增大。CdS QDs數(shù)量越多，對 g-C3N4的增強效果越明顯，電流值越大。基于此，實現(xiàn)對 PKA活性的檢測。我們通過抑制劑鞣花酸對 PKA抑制作用的研究，進一步擴寬了制備的傳感器的應(yīng)用。并且，我們利用該實驗策略對胃癌患者血清和乳腺癌患者的乳腺組織中的 PKA活性進行了研究，結(jié)果表明該傳感器同樣適用于實際樣品的檢測。因此，本項工作提出的光電化學(xué)策略在 PKA活性和抑制劑篩選以及實際

6、樣品檢測方面具有巨大的潛力。
　　(3)基于光信號分子 g-C3N4和 MOFs材料 Au-ZIF-8來增強光信號強度，提出了一種靈敏的光電化學(xué)傳感器。實驗中 TiO2可以特異性識別磷酸基團，基于此，合成了復(fù)合材料TiO2/g-C3N4。Au-ZIF-8作為一種MOFs材料，具有MOFs本身的性質(zhì)，在ZIF-8和金納米顆粒復(fù)合的反應(yīng)中，金納米顆粒的生成尺寸受到ZIF-8的影響，控制在5 nm左右，且均勻分布在ZIF-8的表面，增加

7、了基質(zhì)多肽的結(jié)合位點，利于信號擴增。通過Au-S鍵，捕獲基質(zhì)多肽，緊接著，PKA將其催化磷酸化，進而結(jié)合信號分子，在電子供體 AA中檢測信號大小。該光電化學(xué)傳感器實現(xiàn)了 PKA活性的靈敏檢測，線性方程為 I(nA)=136.89logc+259.298(R=0.993)，檢出限為0.02 U/mL(S/N=3)。通過抑制劑鞣花酸對 PKA活性抑制作用的研究，進一步擴寬了制備的傳感器的應(yīng)用性。因此，實驗提出的光電化學(xué)策略在激酶活性和激酶抑

8、制劑篩選方面具有巨大的潛力。
　　(4)基于在溶液中的PKA催化磷酸化反應(yīng)以及PAMAM樹狀高分子和ALP引起的信號擴增策略，提出了一個新穎的光電化學(xué)實驗來檢測 PKA活性。實驗策略中，PKA磷酸化過程在溶液中完成而不是在電極表面進行，這個實驗過程操作簡單，而且反應(yīng)物能夠充分接觸，使反應(yīng)充分進行。另外，為了將磷酸化的基質(zhì)多肽固定于電極表面，我們合成了復(fù)合材料 TiO2/g-C3N4，并做了表征。一方面，TiO2/g-C3N4中的

9、TiO2可以與基質(zhì)多肽的磷酸基團特異性結(jié)合，另一方面，TiO2/g-C3N4中的 g-C3N4可作為光信號分子。當(dāng)依次固定復(fù)合材料 TiO2/g-C3N4和磷酸化的基質(zhì)多肽于電極上后，通過PAMAM上的羧基和多肽上以及 ALP上的氨基連接，將 PAMAM樹狀高分子和 ALP捕獲在電極上，在含有豐富羧基的 PAMAM樹狀高分子的協(xié)助下，捕獲在電極上的ALP數(shù)量增多。ALP催化檢測液中的 AAP原位產(chǎn)生電子供體 AA，隨著 ALP數(shù)量增多，