紅色非硫磺菌生產(chǎn)可降解塑料方面的基礎(chǔ)研究.pdf

1、本文研究紅色非硫磺菌（混菌）和沼澤紅假單胞菌在累積聚β-羥基丁酸（PHB）作為生產(chǎn)可降解塑料主要原料方面的應(yīng)用。研究從以下七個(gè)方面著手：1、確定實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)紅色非硫磺混合菌以及沼澤紅假單胞菌的具體培養(yǎng)條件；2、實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)紅色非硫磺混合菌以及沼澤紅假單胞菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；3、菌體胞內(nèi)累積物的確定和菌體內(nèi)累積PHB的驗(yàn)證；4、PHB標(biāo)準(zhǔn)物的定性定量分析及菌體內(nèi)累積的驗(yàn)證；5、酯化方法的改良；6、紅色非硫磺混合菌以及沼澤紅假單胞菌累積PHB最

2、佳條件的確定； 7、胞內(nèi)累積PHB的嘗試提取。 研究結(jié)果表明： 1、實(shí)驗(yàn)室條件下紅色非硫磺混合菌的最佳生長(zhǎng)條件為以2-4g/L無(wú)水乙酸鈉為碳源，1.5g/L硫酸銨為氮源，生長(zhǎng)因子添加量為1.5mL/L，微量元素液的添加量為1.5mL/L，培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH為中性（培養(yǎng)基采用光合細(xì)菌通用培養(yǎng)基），接種量為50％，于日光燈下室溫約30℃進(jìn)行光照厭氧培養(yǎng)；沼澤紅假單胞菌的最佳生長(zhǎng)條件為以2-4g/L無(wú)水乙酸鈉為碳源，1.5g/L氯

3、化銨為氮源，生長(zhǎng)因子添加量為1.5mL/L，微量元素液的添加量為1.5mL/L，培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH為中性（7.0左右），接種量為50％，于日光燈下室溫30℃進(jìn)行光照厭氧培養(yǎng)。 2、在擴(kuò)大培養(yǎng)的基礎(chǔ)上對(duì)兩種菌體內(nèi)是否能夠累積PHB進(jìn)行初步確定，通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡放大1000倍可以觀察到兩種菌體內(nèi)都有疑似PHB的白色脂粒點(diǎn)，通過(guò)送樣至上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院（原上海第二醫(yī)科大學(xué)）電鏡分析中心和同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院電鏡分析中心進(jìn)行切片分析

4、，能清楚的看到菌體內(nèi)的PHB脂粒。 3、通過(guò)方法篩選最后確定采用高效氣相色譜法（GC）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)PHB進(jìn)行分析，并使用氣-質(zhì)連用（GC-MS）對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，酯化后產(chǎn)物β-羥基丁酸甲酯在本試驗(yàn)條件下氣相色譜保留時(shí)間為6.7min；通過(guò)對(duì)兩種菌液進(jìn)行氣相色譜分析進(jìn)一步確定了菌體對(duì)PHB的累積。 4、酯化的方法基本按照Sophie Jan等的氣相色譜法進(jìn)行分析，取2mL菌液直接進(jìn)行酯化，改良之處為硫酸甲醇體積比為1: 1，菌

5、體酯化形式可在洗滌離心后直接進(jìn)行酯化，內(nèi)標(biāo)物苯甲酸甲酯用量為100μL/2mL，容器選用螺口密封瓶。 5、兩種菌在現(xiàn)有的碳源、氮源的基礎(chǔ)上都可以保證良好的生長(zhǎng)和對(duì)PHB的累積，在保證生長(zhǎng)的基礎(chǔ)上適當(dāng)?shù)脑黾犹嫉瓤稍黾永鄯e量，碳源氮源的追加對(duì)菌體累積量的影響不是很大，適當(dāng)?shù)脑黾踊蛘呤亲芳渔V離子的含量會(huì)使菌體累積PHB的量有所提高，初始培養(yǎng)基中性或者是略為偏堿都有利于PHB的累積。 6、在試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，粗略計(jì)算得出PHB的累

6、積量最大約為50％，雖然沒(méi)有達(dá)到有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的最高值70％，但是累積量仍然比較大，所以提取的可行性很大，由于試驗(yàn)條件的限制目前只是確定了提取的可行方法。 7、酯化方法的再改良：將Sophie Jan等的氣相色譜法改進(jìn)后在本試驗(yàn)中的可行性提高了很多，但還存在一些問(wèn)題如溫度、催化劑、容器等，再改良采用降低酯化溫度的同時(shí)增加催化劑（硫酸）濃度的方法，經(jīng)過(guò)GC檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，在此條件下雖然對(duì)PHB的定性并沒(méi)有很大的影響，副產(chǎn)物卻相對(duì)增多，在