蛋白質(zhì)與核酸和小分子的相互作用的共振瑞利散射光譜及其分析應(yīng)用.pdf

1、近年來，蛋白質(zhì)與核酸之間的反應(yīng)由于其重要的生理學(xué)意義而受到廣泛的關(guān)注，多種分析方法都應(yīng)用于這兩種生物大分子之間的反應(yīng)及其識別機(jī)理的研究。但分子光譜法在該領(lǐng)域中的應(yīng)用則較少。共振Rayleigh散射(ResonanceRayleighScattering，RRS)技術(shù)作為新興的、簡便的、高靈敏的分析技術(shù)受到人們的廣泛關(guān)注，同時由于其對大分子非鍵作用，如締合、聚集、偶極—偶極作用等非常敏銳，這使其具有生物大分子的間的反應(yīng)機(jī)理研究和測定、表征

2、及反應(yīng)歷程的研究極為有利。因此，我們以RRS法和吸收光譜法研究了蛋白質(zhì)和核酸之間的相互作用、光譜特征、反應(yīng)機(jī)理，本文還研究了用鞣酸測定蛋白質(zhì)和某些金屬螫合物測定核酸的新RRS法。 1蛋白質(zhì)與DNA相互作用的吸收光譜研究 本文嘗試用紫外吸收光譜法研究蛋白質(zhì)與核酸的相互作用，并將其應(yīng)其用于反應(yīng)機(jī)理的探討。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)-核酸間的反應(yīng)可引起紫外吸收光譜的變化。通過對其變化的研究，可以提供關(guān)于核酸-蛋白質(zhì)相互作用的一些新的信息

3、，基于此反應(yīng)還可發(fā)展出紫外分光光度法測定核酸、蛋白質(zhì)的新方法。當(dāng)用胰蛋白酶測定DNA時，對于不同DNA的檢出限在191.4ng至276.4ng之間，而對RNA靈敏度較低。當(dāng)用hsDNA測定蛋白質(zhì)時，對不同的蛋白質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)在2.9×105-9.92×106mol-1·cm-1之間，其相應(yīng)檢測限分別是27.4μg·mL-1(HSA)，2.0μg·mL-1(Papain)，4.1μg·mL-1(Pepsin)，2.0μg·mL-1(BS

4、A)和28μg·mL-1(Trypsin)。 2胰蛋白酶與DNA相互作用的吸收光譜研究本文研究了胰蛋白酶-DNA體系。文中研究了反應(yīng)體系的RRS光譜特征、適宜的反應(yīng)條件、反應(yīng)的結(jié)合比，并推測了兩者的結(jié)合方式?；诖朔磻?yīng)還可將其用于核酸和蛋白質(zhì)的相互測定。 當(dāng)用hsDNA測定胰蛋白酶時，檢出限為39.0ng·mL-1，而當(dāng)用胰蛋白酶測定DNA時，方法具有較高的靈敏度，對DNA的檢出限達(dá)0.42～1.06ng·mL-1之間。

5、 3hsDNA與蛋白質(zhì)相互作用的RRS研究我們研究了hsDNA與人血清白蛋白、牛血清白蛋白、胃蛋白酶、術(shù)瓜蛋白酶、血紅蛋白和γ球蛋白相互作用的RRS光譜特征，結(jié)果表明上述幾種蛋白質(zhì)與hsDNA發(fā)生相互作用，且能夠引起RRS不同程度地增強(qiáng)。文中研究了反應(yīng)體系的RRS光譜特征、適宜的反應(yīng)條件，并結(jié)合其他分子光譜方法推測了兩者的結(jié)合方式。此反應(yīng)可以用于蛋白質(zhì)和核酸的相互反應(yīng)。當(dāng)用hsDNA測定不同的蛋白質(zhì)，其線性范圍為0.05～12μ

6、g·mL-1(HSA)、0.04～15μg·mL-13(BSA)、0.1～20μg·mL-1(γglobin)、0.1～18μg·mL-1(hemoglobin)，其檢測限從12.6ng·mL-1到43.4ng·mL-1。而用各種蛋白質(zhì)測定hsDNA時，分別在0.4×10-3～1.5μg·mL-1(HSA)、0.3×10-3～1.6μg·mL-13(BSA)、0.1×10-3～2.7μg·mL-1(Papain)、0.4×10-3～2.

7、5μg·mL-1(Pepsin)、0.2×10-3～2.8μg·mL-1(γglobin)、1.4×10-3～1.9(hemoglobin)的范圍內(nèi)與△I呈直線關(guān)系，并且對于hsDNA的檢出限分別為1.2ng·mL-1(HSA)、0.7ng·mL-1(BSA)、0.3ng·mL-1(Papain)1.1ng·mL-1(Pepsin)0.6ng·mL-1(γglobin)和0.4ng·mL-1(hemoglobin)。 4鞣酸RR

8、S法測定蛋白質(zhì)本文研究了人血清白蛋白、牛血清白蛋白、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶與鞣酸(tannicacid，TC)相互作用的RRS光譜特征，結(jié)果表明人血清白蛋白與牛血清白蛋白和鞣酸的相互作用能夠引起RRS的更大增強(qiáng)。文中研究了反應(yīng)體系的RRS光譜特征、適宜的反應(yīng)條件、反應(yīng)的結(jié)合比，并推測了兩者的結(jié)合方式?；诖朔磻?yīng)還可將其用于核酸和蛋白質(zhì)的相互測定。當(dāng)用鞣酸測定BSA時，在0.04～100μg·mL-1范圍內(nèi)，RRS響應(yīng)與濃度呈線性

9、關(guān)系，其檢出限為12.8ng·mL-1.而HSA線性范圍為0.03～90μg·mL-1，檢出限為10.4ng·mL-1。實驗條件下其它蛋白響應(yīng)不高，因此該方法可以用于在有其它蛋白共存的情況下測定白蛋白，應(yīng)用該方法測定了血清中的白蛋白含量，結(jié)果與考馬斯亮藍(lán)法結(jié)果相符合。 5BDHA金屬螯合物測定hsDNA本文研究了2，2′-[[1,1′-二萘]-2,2′-二代雙(氧)]雙[N-(2-羥乙基)-乙酰胺(BDHA)與Cu2+，Al3+

10、，Cd2+形成的配合物與DNA相互作用的RRS光譜特征，結(jié)果表明BDHA與三種金屬離子及hsDNA形成三元配合物之后，能引起RRS的增強(qiáng)。三種絡(luò)合物具有相似的光譜特征，它們的最大RRS波長位于357nm，另在310nm和537nm處有二略低的RRS峰，但最大RRS峰均位于358nm處。文章研究了反應(yīng)體系的RRS光譜特征、適宜的反應(yīng)條件。當(dāng)用BDHA金屬螯合物測定hsDNA時，檢出限分別為42.0ng·mL-1(BDHA-Cu2+)、88