單分子熒光成像技術(shù)在液-固界面研究中的應(yīng)用.pdf

1、單分子檢測(Single Molecule Detection，SMD)可以在單分子水平上對(duì)生物分子的構(gòu)象變化、動(dòng)力學(xué)、分子之間相互作用以及對(duì)單個(gè)分子的操縱進(jìn)行研究。與傳統(tǒng)分析方法只能提供復(fù)雜體系參數(shù)的平均值相比，SMD能探測到處于非平衡態(tài)下的個(gè)體行為和平衡狀態(tài)下體系的漲落，追蹤掩蓋在平衡狀態(tài)下的微觀動(dòng)力學(xué)變化過程。此外，SMD不要求隨時(shí)間變化過程中的大量分子的狀態(tài)保持同步，且能捕捉到被宏觀觀測所淹沒的極少數(shù)的中間體或過渡狀態(tài)。

2、 生物大分子在液-固界面的行為研究有十分重要的意義，例如在生物芯片、生物傳感器等領(lǐng)域中，常需要研究生物分子在基底的非特異性吸附。利用單分子檢測技術(shù)研究生物大分子在液-固界面的吸附、解吸附的詳細(xì)動(dòng)力學(xué)過程，對(duì)于研究生物傳感器的設(shè)計(jì)、色譜和毛細(xì)管電泳過程中的基底選擇等方向有重要意義。故本論文應(yīng)用單分子熒光成像技術(shù)研究了YOYO-1標(biāo)記的DNA分子在液-固界面的單分子行為。具體內(nèi)容如下： (1)圖像處理是單分子實(shí)驗(yàn)中非常重要的一部分，

3、直接影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。針對(duì)本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象--DNA分子，當(dāng)熒光照片上DNA分子數(shù)較少時(shí)，人工計(jì)數(shù)并非很復(fù)雜，但當(dāng)DNA分子總數(shù)很多時(shí)，人工計(jì)數(shù)的工程量則較大，浪費(fèi)工作者很多時(shí)間，此時(shí)利用Image J軟件的自動(dòng)計(jì)數(shù)功能則能快速、準(zhǔn)確的得到結(jié)果，因此很有必要對(duì)Image J軟件在單分子熒光成像中的應(yīng)用進(jìn)行研究。而在利用Image J軟件分析和優(yōu)化其熒光照片時(shí)，閾值、滾動(dòng)球半徑和單個(gè)DNA分子的平均最小占據(jù)的像素值的設(shè)置非常

4、重要，因此，論文針對(duì)本實(shí)驗(yàn)中所獲取的DNA單分子圖像的特點(diǎn)，利用Image J軟件找到了適用于本實(shí)驗(yàn)中的DNA分子的扣除背景，快速計(jì)算吸附及未吸附的DNA分子個(gè)數(shù)，獲取單個(gè)。DNA分子的動(dòng)力學(xué)行為，測量熒光強(qiáng)度等圖像解析操作的最佳參數(shù)等，而在此最佳參數(shù)下得到的DNA分子總數(shù)與人工計(jì)數(shù)的結(jié)果基本一致，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。 (2)應(yīng)用全內(nèi)反射熒光顯微鏡，利用YOYO-1標(biāo)記的λ-DNA分子作為探針研究了三種不同硅烷化試劑修飾的蓋玻片表面的

5、性質(zhì)，在不同的pH值下，考察pH值對(duì)單個(gè)DNA在這三種不同表面行為(自由運(yùn)動(dòng)和吸附)的影響，并應(yīng)用接觸角(Contact Angle，CA)表征了這三個(gè)不同表面的性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)表明，在3-巰丙基三甲氧基硅烷((3-mercaptopropyl)trimethoxysilane，3-MPTS)和正辛基三乙氧基硅烷(n-Octyltriethoxysilane，OTES)修飾的表面，在pH=8.20時(shí)，DNA分子全部自由運(yùn)動(dòng)，隨著pH值的降低，

6、DNA吸附率隨之增大，根據(jù)接觸角(CA)表征結(jié)果，這兩個(gè)表面是親水表面，但是用3-MPTS修飾的蓋玻片表面更親水。然而利用三乙氧基(3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，8-十三氟辛基)硅烷(1H，1H，2H，2H-Perfluorooctyltriethoxysilane，PFOTES)修飾的表面是疏水的，在pH=8.20時(shí)，個(gè)別DNA分子已經(jīng)吸附在其表面，隨著pH值的降低，DNA在其表面的吸附率也逐漸增大。在相同pH值下，

7、DNA分子在三種硅烷化試劑修飾的蓋玻片表面的吸附率區(qū)別比較明顯，其順序依次為3-MPTS

8、微鏡(Atomic Force Microscope，AFM)表征了SiO2納米粒子薄膜表面的性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)表明，隨著pH值的降低，DNA分子在其表面的吸附率隨之增大。DNA分子在SiO2納米粒子薄膜表面的吸附行為是靜電作用和疏水作用共同作用的結(jié)果，但是起主導(dǎo)作用的是疏水作用。此外，相同pH值下，與文獻(xiàn)中報(bào)道的DNA在玻片上的吸附率相比，DNA在SiO2納米粒子薄膜表面的吸附率要大的多，這是由于SiO2納米粒子的比表面積大，表面活性位點(diǎn)多，