新型毛細管電泳光學檢測器的研制及應(yīng)用研究.pdf

1、高效毛細管電泳（CE）是近年來發(fā)展最快的分離分析技術(shù)之一，由于該技術(shù)具有簡單、高效、快速、微量、經(jīng)濟、清潔、易于自動化和環(huán)境污染少等優(yōu)點，目前已在生命科學、生物醫(yī)學和環(huán)境檢測等領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。由于CE溶質(zhì)區(qū)帶的超小體積導致光程太短，需要高靈敏度的檢測器與之匹配，因此檢測器的研制一直是CE技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵問題。目前已采用的檢測器主要有：紫外可見光吸收、激光誘導熒光、化學發(fā)光（CL）、質(zhì)譜、核磁共振和電化學檢測器等，其中激光誘導熒光和C

2、L是最靈敏的兩種檢測器。但常規(guī)的激光誘導熒光檢測器，必須采用激光器作為激發(fā)光源，例如氬離子激光器和氦—鎘激光器，這些激光器不僅可供選擇的激發(fā)波長有限，而且價格昂貴、體積龐大，使用壽命短，因而大大限制了CE激光誘導熒光檢測法的應(yīng)用。而對于CE－CL檢測，盡管已發(fā)展了多種類型的檢測器，但目前的高靈敏檢測主要集中在無機離子的檢測方面，而用于檢測生物活性分子，其靈敏度一般都不高，在生物樣品分析中的應(yīng)用也較少。因此，研制通用性的高靈敏光學檢測器，

3、建立高靈敏CE分離分析方法，并應(yīng)用于生物樣品分析，對于推動生命科學和生物醫(yī)學研究的發(fā)展，具有重要的意義。 本研究工作旨在發(fā)展一些新的CE光學檢測器，建立生物體內(nèi)一些重要生物活性分了的高靈敏檢測方法，并應(yīng)用于實際樣品分析，從而獲取一些有重要價值和理論意義的數(shù)據(jù)和新發(fā)現(xiàn)。為此主要開展了以下三個方面的工作。 1.設(shè)計組裝了CE光導纖維發(fā)光二極管（LED）誘導熒光檢測器，并建立相應(yīng)的CE分析系統(tǒng)。該系統(tǒng)以非常便宜的LED作為激發(fā)

4、光源，用光導纖維將光直接導入毛細管內(nèi)，在溶液中激發(fā)被測物質(zhì)產(chǎn)生熒光，避免了毛細管壁的散射和反射現(xiàn)象，因而具有較高的靈敏度。以萘二甲醛（NDA）標記的氨基酸和熒光素異硫氰酸酯（FITC）標記的氨基酸混合物為試驗化合物，考察了該系統(tǒng)的分離和測試性能。實驗結(jié)果表明該系統(tǒng)具有良好分離效果，高的靈敏度，檢測限在10<'-8>～10<'-9>mol.L<'-1>之間，各種性能接近CE激光誘導熒光檢測系統(tǒng)。另外，由于在紫外和可見光范圍內(nèi)，各個波長段均

5、可得到相應(yīng)的LED，因而與CE激光誘導熒光檢測系統(tǒng)相比，該檢測系統(tǒng)具有更加廣泛的應(yīng)用前景。利用該系統(tǒng)，已分別建立了生物樣品中胍基丁胺和D-天冬氨酸，D-谷氨酸的CE分析方法。并對大鼠大腦、大鼠胃及人血清、人尿液中的胍基丁胺的含量進行了測定，首次測得人尿液中含有30～60ng/mL.的胍基丁胺。應(yīng)用于小鼠大腦中D-天冬氨酸和D-谷氨酸的含量測定時，對其注射神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1.2.3.6-四氫吡啶（MPTP），使其發(fā)生了帕金森疾

6、病癥狀后的小鼠大腦組織中，對D-Asp和D-Glu含量的變化情況進行了考察。發(fā)現(xiàn)隨MPTP用藥時間的增長，帕金森疾病的癥狀愈來愈明顯，其D-Asp和D-G1u含量亦明顯增高，用藥5天后含量達最大值。為生物醫(yī)學研究提供了有重要參考價值和理論意義的數(shù)據(jù)。 2.設(shè)計組裝了一套新的CE-CL檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用四通式接口和套管式在線活動檢測窗口，光電倍增管緊貼反應(yīng)毛細管的檢測窗，并在檢測窗口下放置一面反光鏡。因此檢測池密閉性能好，收集C

7、L的效率高。與現(xiàn)有大多數(shù)CL檢測器相比，測定氨基酸時的靈敏度提高了一個數(shù)量級。利用該系統(tǒng)，分別建立了生物樣品中葉酸，氨基酸和對乙酰氨基酚等物質(zhì)的測定方法，并已分別應(yīng)用于葉酸片劑、果汁和人尿液中葉酸含量的測定，人血清中14種氨基酸含量的測定，以及人尿液中對乙酰氨基酚含量的測定，并對對乙酰氨基酚的人體內(nèi)藥代動力學進行了研究。采用CE-CL檢測技術(shù)測定上述物質(zhì)，靈敏度高，選擇性好，國內(nèi)外均未見有同類工作報道。 3．組裝了一套CE激光誘

8、導熒光檢測系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)建立了大鼠大腦中D－絲氨酸含量的CE激光誘導熒光檢測方法。該方法以4－氟－7－硝基－2，1，3－苯并噫二唑（NBD-F）為衍生試劑，羥丙基－β－環(huán)糊精為手性選擇劑，對D/L-絲氨酸對映體的NBD-F衍生物，進行了手性拆分研究，并對大鼠大腦中D-絲氨酸的含量進行了檢測。測得大鼠大腦中D-絲氨酸含量在95～140nmol/g之間。另外，利用該系統(tǒng)建立了大鼠大腦中D/L-天冬氨酸含量的測定方法，并測定了在正常和腦缺血

9、情況下，大鼠大腦皮質(zhì)中D/L-天冬氨酸的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常情況下每克濕的大腦皮質(zhì)組織中，含142.8nmol L－天冬氨酸和49.1 nmol D－天冬氨酸，但在腦缺血情況下，L-天冬氨酸的含量快速升高，而D-天冬氨酸的含量反而降低。腦缺血30min時，L-天冬氨酸的含量為241.2nmol，升高了68.9％，D-天冬氨酸的含量為31.3nmol，降低了36.3％。這一結(jié)果表明，生理學中的興奮性氨基酸可能僅指L－氨基酸，而不包括它們